IP6对人结肠癌细胞HT29凋亡Caspase3基因作用
发表时间：2011-12-12 浏览次数：369次
作者：宋莉,宋扬 作者单位：青岛大学医学院营养研究所,山东 青岛 266021
【摘要】目的 研究肌醇六磷酸(IP6)对人结肠癌细胞HT29的诱导凋亡作用，检测Caspase3基因在IP6处理细胞前后表达的变化，并对IP6诱导人结肠癌细胞HT29的凋亡机制进行初步探讨。方法 不同浓度的IP6以不同时间作用于体外培养的HT29细胞，用MTT法检测IP6持续作用对癌细胞增殖的影响;透射电镜观察癌细胞超微结构的变化;用RTPCR方法对IP6作用前后以及作用不同浓度和时间的癌细胞内Caspase3活性进行检测。结果 IP6能显著抑制人结肠癌细胞HT29生长，呈剂量与时间依赖性;IP6作用后，HT29细胞出现凋亡的形态学改变;与对照组相比，不同浓度的IP6作用不同时间后，Caspase3 mRNA表达均升高(F=8.173～91.755,q=3.960～17.095，P<0.05), IP6作用6个月组Caspase3 mRNA表达升高较其他时间组显著(q=12.858～14.890，P<0.01)。结论 IP6具有抑制人结肠癌细胞HT29增殖和诱导凋亡的作用;IP6长期作用诱导细胞凋亡更加显著;Caspase3基因参与细胞的凋亡调节机制，发挥重要作用。
【关键词】 植酸,HT29细胞,细胞凋亡 基因 Caspase3
[ABSTRACT] Objective To study the mechanisms of apoptosis induced by Inositol Hexaphosphate (IP6) in HT29 human colon carcinoma cell line. Methods HT29 cells cultured in vitro were exposed to various concentrations of IP6 applied at different time. The constant effect of IP6 on HT29 cells proliferation was evaluated by MTT assay. The morphological changes of HT29 cells were observed under electronic microscope.The activity of Caspase3 in HT29 cells was detected by RTPCR assay. Results IP6 remarkbly suppressed the growth of HT29 cells. The suppression was a dosedependent and timedependent manner. HT29 cells showed morphological changes of apoptosis after IP6 treatment.Compared with the control group, the expression of Caspase3 mRNA was significantly increased at all IP6 concentrations (F=8.173-91.755,q=3.960-17.095,P<0.05). The upregulation of Caspase3 mRNA expression was significantly higher in the 6month group than the rest groups (q=12.858-14.890,P<0.01). Conclusion IP6 can suppress the proliferation and induce the apoptosis of HT29 cells. Longer IP6 treatment induced stronger apoptosis. Caspase3 plays an important role in the regulatory mechanisms of cells apoptosis.
[KEY WORDS] Phytic acid; HT29 cells; Apoptosis; Genes, caspase3
肌醇六磷酸(IP6)又名植酸，是植物体内重要的含磷化合物，在谷类和豆类中含量居高，平均可达1%～5%[1]。近年来研究发现，IP6可以抑制多种肿瘤细胞系的生长，具有广泛的抗肿瘤活性[2]。已有研究证实，IP6短期作用对人结肠癌细胞系HT29细胞的增殖具有一定的抑制作用，并且这种抑制作用具有剂量和时间的依赖关系。本实验旨在研究IP6对人结肠癌细胞HT29的诱导凋亡作用，并检测Caspase3基因在细胞凋亡前后表达的变化，对IP6诱导人结肠癌细胞HT29的凋亡机制进行初步探讨。现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞系 人结肠癌细胞系HT29,购自北京协和医科大学细胞库。
1.1.2 主要试剂及来源 IP6为钠盐，Sigma公司产品;DMEM/Ham F12培养基及胎牛血清均为美国GIBCO公司产品;四甲基偶氮唑盐(MTT)，Sigma公司产品;TRIzol试剂，Invitrogen公司产品;反转录试剂盒，Promega公司产品;Taq DNA聚合酶，上海中科开瑞生物芯片科技股份有限公司产品。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 人结肠癌细胞系HT29常规培养于含体积分数0.05胎牛血清、105 U/L青霉素和100 mg/L链霉素的DMEM/Ham F12培养基中。IP6长期作用的HT29细胞培养于含有不同浓度IP6的培养液中(同时含有体积分数0.05胎牛血清，105 U/L青霉素和100 mg/L链霉素)，在37 ℃，体积分数0.05的CO2培养箱中贴壁生长，定期换液，传代。
1.2.2 MTT法检测IP6对HT29细胞增殖的影响 ①IP6的作用方式：以不同浓度的IP6(0、1.8、3.3、5.0、8.0、13.0 mmol/L)连续作用细胞6 d，每2 d换液一次;对照组每2 d换不含IP6的正常培养液一次。②MTT检测：准确称取50 mg MTT粉剂，放入小烧杯中，加50 mL PBS(0.01 mmol/L，pH 7.4)溶液，磁力搅拌器完全溶解后，以装有微孔滤膜(0.22 μm)的针式滤器过滤除菌，密封，置4 ℃冰箱避光保存备用。将指数增殖期细胞加消化液消化制成单细胞悬液，计数,调整细胞密度为2×108/L，取上述细胞悬液接种于96孔板，每孔100 mL。于37 ℃、体积分数0.05的CO2培养箱中培养孵育过夜，使细胞贴壁生长。实验组换含不同浓度IP6(1.8～13.0 mmol/L)的培养液，对照组换不含IP6的培养液，37 ℃、体积分数0.05的CO2培养箱中培养孵育。在设计的时间点(2、4、6 d)去掉培养液，加入1.0 g/L 的MTT 50 μL，37 ℃孵育4 h。细胞内形成的蓝色结晶溶解于150 μL DMSO，酶联免疫检测仪于490 nm波长处检测各孔吸光度值。每组做3个平行样。
1.2.3 透射电镜观察不同浓度IP6作用不同时间后HT29细胞内超微结构的变化 ①IP6的作用方式：HT29人结肠癌细胞在37 ℃，体积分数0.05的CO2培养箱中贴壁生长，共分3 d、3月、6月3等个作用时间段，每个时间段内分0、1.8和3.3 mmol/L等3个IP6浓度组，以正常培养的HT29细胞作为对照。②透射电镜观察细胞：收集细胞，25 g/L的戊二醛4 ℃固定4 h;用PBS漂洗细胞3次，每次10 min，并离心成团状。10 g/L的锇酸4 ℃固定2 h，用PBS冲洗3次，每次10 min。体积分数0.30、0.50、0.70、0.90、1.00的乙醇逐级脱水，每次10 min，其中体积分数1.00的乙醇脱水2次。Epon 812环氧树脂包埋，37、45、65 ℃温箱固化，每级温度24 h。Ultracut E超薄切片机切片;醋酸双氧铀硝酸铅染色。日本JEOL公司JEM1200EX透射电镜观察。
1.2.4 半定量RTPCR法检测IP6对HT29细胞Caspase3 mRNA表达的影响 IP6的作用方式同透射电镜法;按照TRIzol试剂说明书提取RNA。Caspase3引物序列与内参照βaction引物序列均用Primer 5.0软件设计，并经过GenBank验证，由上海生工生物技术服务有限公司合成。Caspase3引物序列，forward:5′TTTGTTTGTGTGCTTCTGAGCC3′;reverse:5′GATGTTCTGGAGAGCCCCG3′,扩增产物片段长度为400 bp。βaction引物序列，forward:5′CTTAGCACCCCTGGCCAAG3′;reverse:5′GATGTTCTGGAGAGCCCCG3′,扩增产物片段长度为152 bp。RT的反应体系参照试剂盒说明书，反应条件为：混匀后42 ℃ 1 h，99 ℃加热5 min，然后快速冷却到4 ℃。将反转录所得的cDNA用作PCR反应的模板，-20 ℃保存备用。Caspase3 PCR扩增反应体系为25 μL：10×buffer2.5 μL，MgCl2 2 μL，dNTP 0.5 μL，Taq酶0.2 μL，上下游引物各1.5 μL，cDNA模板3 μL，混匀后，瞬时离心，加20 μL石蜡油。反应条件为：94 ℃预变性5 min;然后94 ℃ 30 s，52 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，循环35次;最后72 ℃充分延伸7 min。4 ℃浸润。βaction反应体系25 μL：10×buffer 2.5 μL，MgCl2 2 μL，dNTP 0.5 μL，Taq酶0.2 μL，上下游引物各1.5 μL，cDNA模板1.5 μL，混匀后，瞬时离心，加20 μL石蜡油。反应条件：94 ℃预变性5 min;然后94 ℃ 30 s，52 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，循环35次;最后72 ℃充分延伸7 min。4 ℃浸润。扩增产物经15 g/L琼脂糖凝胶电泳，紫外线透射仪下观察结果并拍照，通过天能凝胶图像分析软件读取目的电泳条带的斑点密度扫描值，每个样本均检测3次。将目的基因条带与βaction条带的比值作为目的基因表达的相对量。
1.3 统计学处理
采用SPSS 11.5统计软件进行分析。计量资料以±s表示，多组比较采用单因素方差分析;两组比较采用t检验。
2 结果
2.1 不同浓度IP6对HT29细胞生长的抑制作用
IP6持续作用对结肠癌细胞株的生长具有抑制作用，并且这种抑制作用随IP6浓度的增加而增大，随作用时间的延长而明显，具有浓度依赖关系和时间依赖关系。见图1。
2.2 IP6作用后HT29细胞超微结构的变化
由图2可见，同对照组HT29细胞相比较，经IP6作用的HT29细胞出现凋亡现象，形态改变典型，表现为染色体固缩，电子密度增高，细胞浆浓缩，细胞膜保存完整，表面微绒毛和伪足减少，可见凋亡小体的出现。凋亡小体呈球形或月牙形，以核膜消失、染色体断裂成碎片和细胞器等胞质成分聚集为特征。IP6作用6个月组以细胞裂解表现居多。
2.3 不同浓度的IP6作用不同时间对HT29细胞Caspase3 mRNA表达的影响
PCR产物经凝胶电泳鉴定，扩增片段特异性强，Caspase3条带大小约400 bp，βaction条带大小约152 bp，均与预期大小相符(图3)。不同浓度IP6作用不同时间后HT29细胞Caspase3 mRNA表达的相对量见表1。由表1可以看出，与对照组相比，各IP6作用组Caspase3 mRNA表达均升高(F=8.173～91.755,q=3.960～17.095，P>0.05)，且具有时间效应关系。其中，与其他时间组相比，6个月组Caspase3 mRNA表达升高有统计学意义(q=12.858～14.890，P<0.01)，但是3 d和3个月IP6处理组间差异不显著(q=0.201、0.177，P>0.05)。
3 讨论
结肠癌是严重危害人类健康的常见的恶性肿瘤，其发病率仅次于肺癌和胃癌居第3位。一些流行病学资料表明，富含IP6的纤维食物对结肠癌具有预防作用，提示IP6具有预防结肠癌的功能[2]。有研究表明，IP6能选择性抑制肿瘤细胞的生长，诱导其凋亡[3,4]。本实验应用MTT法研究显示，IP6对人结肠癌细胞HT29具有显著的增殖抑制作用，并且这一作用呈现出明显的剂量和时间依赖性。同时，在电镜下也观察了IP6作用后HT29细胞凋亡的超微结构变化。由此我们认为，IP6可能通过促进HT29细胞凋亡而实现其对细胞生长的抑制。
近几年国外资料表明，IP6可以通过调控细胞信号传导来抑制细胞的增殖，使细胞循环周期出现停滞，最终诱导细胞凋亡的发生[5,6]。而通过线粒体释放凋亡酶激活因子激活Caspase是细胞凋亡信号传导的主要途径之一。正常情况下Caspases在细胞内以无活性的酶原形式存在，当凋亡过程被启动后，凋亡信号可传导至Caspases酶原，使其部分肽链发生水解，形成有活性的Caspases，然后各种Caspases产生级联反应，最终诱导细胞发生凋亡。
表1 IP6不同浓度和时间对HT29细胞Caspase3 mRNA表达的影响(略)
图1 IP6连续作用对HT29细胞增殖的影响(略)
图2 透射电镜观察IP6作用后HT29细胞超微结构的变化(略)
a:未经IP6作用的HT29细胞，未见凋亡小体(×5 000);b:3.3 mmol/L IP6作用3 d的HT29细胞，可见凋亡小体(×9 000);c:3.3 mmol/L IP6作用6个月的HT29细胞，可见凋亡小体，细胞裂解多(×3 000)
图3 Caspase3 mRNA的表达(略)
①:DNA Marker;②～④:分别为IP6 0、1.8、3.3 mmol/L作用3 d;⑤～⑦:分别为IP6 0、1.8、3.3 mmol/L作用3个月;⑧～⑩:分另为IP6 0、1.8、3.3 mmol/L作用6个月
迄今已发现Caspase家族有16个成员，其中起核心作用的是Caspase3，是凋亡活动的主要参与成分。Caspase3被激活后可裂解产生相对分子质量1.7万的活性亚单位，后者可进一步激活Caspases活化的核酸内切酶(CAD)，活化的CAD可切割DNA，导致细胞发生凋亡。在多种细胞的凋亡过程中均有Caspase3的活性的变化[7],已有研究表明，IP6可诱导前列腺癌细胞系和宫颈癌细胞系的凋亡，参与凋亡相关酶Caspase9、Caspase3激活，IP6的这种作用具有时间和剂量依赖性[4]。我们的前期体外实验结果显示，IP6短期作用即可以抑制人结肠癌细胞系HT29的增殖，并诱导其凋亡，且具有剂量和时间效应关系，并对IP6作用后HT29细胞抑癌基因和癌基因的变化进行了初步探讨[8～10]。鉴于IP6是一种作用较温和的抗癌物质，其对结肠上皮细胞的保护作用是以一种潜在的、稳定的方式实现，其更大的作用在于协同和预防作用，而治疗作用需要在一个较为长期的过程中去观察，因此，本实验在观察IP6短期作用的同时，还将不同剂量的IP6较长时间(3、6个月)作用于人结肠癌细胞系HT29，其结果显示，IP6能诱导HT29细胞发生凋亡，发挥出明显的体外抗结肠癌的作用;且IP6处理组细胞中 Caspase3的活性升高，其mRNA的表达较对照组明显升高，与对照组及其他作用时间组相比，IP6作用HF29细胞6个月Caspase3 mRNA表达升高明显。这均提示在IP6诱导的HT29细胞凋亡中，Caspase3可能参与了其信号的转导或者凋亡的控制;同时实验结果证实，随着IP6对HT29细胞的作用时间的延长，Caspase3的活性升高更加显著，提示IP6对HT29细胞的长期作用能更有效地诱导细胞凋亡，发挥抗结肠癌的作用，其中升高Caspase3活性可能是其诱导HT29细胞凋亡的重要作用机制之一，也说明IP6对结肠上皮细胞的保护作用需要在一个较为长期的过程中去观察，这为进一步研究提供了有力的实验依据。
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