散发性胃癌中BRCA1基因突变研究

　　作者：朱宏伟,岳秀兰,杨文杰,　曹虹然,白雪峰　　作者单位：1.包头医学院生物化学教研室，内蒙古包头 ;2.包头市第七医院

　　【摘要】目的：检测BRCA1基因第2外显子、第11外显子和第20外显子在胃癌中的突变情况，探讨其与胃癌发病的关系。方法：采用PCR-SSCP(聚合酶链反应-单链构象多态性分析)结合银染的方法，对45例无血缘关系的胃癌患者BRCA1基因第2、11、20外显子进行突变检测。结果：在外显子2、11、20的序列中未发现有突变。结论:在Ashkenazi犹太妇女中发现的两个突变热点185delAG和5382insC以及在家族性乳腺癌中报道较多的3232A突变为G(导致1038号密码子由Glu变为Gly)的三个突变点，可能对中国人群散发性胃癌的发生影响不大，有待于继续研究探讨中国散发性胃癌与BRCA1基因突变的关系。

　　【关键词】 胃癌;BRCA1;PCR-SSCP

　　Study on the Mutation of BRCA1 Gene in Sporadic Gastric Cancer ZHU Hongwei,YUE Xiulan YANG Wenjie, et al (Department of Biochemistry, Baotou Medical College, Baotou 014010,China )

　　Abstract Objective: To study the relationship between BRCA1 mutation and occurrence of gastric cancer by determining the mutation in three exons of BRCA1 gene in sporadic gastric cancer. Methods：A series of 45 patients with gastric cancer without blood relationship to each other were randomly selected for determining the mutation of exons 2, 11 and 20 of BRCA1 by using Polymerase chain reaction(PCR) and Single-strand conformational polymorphism(SSCP) method. Results：No mutations were found in exons 2,11,and 20. Conclusion:185 delAG and 5382insC which are high mutation sites in Ashkenazi Jewish women and 3232A mutation G which is reported in Chinese familial breast cancer do not account much for the occurrence of sporadic gastric cancer in the population of China .The possible relationship is to be confirmed by further study.

　　Key words Gastric cancer;BRCA1;PCR-SSCP

　　胃癌是消化道常见恶性肿瘤，发病率很高,在我国胃癌的死亡率仅次于肺癌，居第二位。每年死于胃癌的患者达16万人。胃癌的发生是多因素多步骤的病理过程，该过程涉及多种原癌基因的激活和抑癌基因的失活。目前研究指出,抑癌基因的失活在肿瘤的发展中所起的作用可能比癌基因的活化更常见和更重要[1]。我们已经研究了c-erbB-2原癌基因的扩增与散发性胃癌的关系，研究结果显示c-erbB-2原癌基因扩增与胃癌的发生有一定关系，与进展期胃癌的浸润能力密切相关[2]。现在需进一步探讨抑癌基因BRCA1的失活与胃癌的关系。

　　乳腺和卵巢癌易感基因BRCA1(breast and ovarian cancer susceptibility gene)是1990年由Hall等[3]发现,1994年由美国科学家Skolnick等首先成功克隆定位[4],并命名为BRCA1,即人类乳腺癌易感基因。自从BRCA1分离克隆以来,大量研究证明,BRCA1基因结构、功能异常与乳腺癌、卵巢癌的发生发展有着十分密切的联系。BRCA1基因突变者的患癌风险明显高于普通群体,与大约45%的遗传性乳腺癌相关[5-6]。而在除乳腺癌和卵巢癌以外的其它癌症中检测出BRCA1基因突变的报道并不多见，其与除乳腺癌和卵巢癌以外的其它癌症的关系仍不能确定，其确切功能和作用机制尚不清楚。为了探讨散发性胃癌患者BRCA1的突变情况，本文采用聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)结合银染的方法，检测了45例散发的胃癌患者BRCA1基因的突变情况。

　　1 材料与方法

　　1.1 检测标本 45例胃癌组织取自包头市第七医院2003年10月至2004年10月期间手术切除新鲜标本，均经病理诊断为胃癌，其中38例取其癌旁正常胃黏膜(距癌灶边缘大于10cm)作为对照。所有标本立即剔除血块及脂肪组织，置于-20℃冰箱中冷冻保存。其中男34例，女11例，年龄31～78岁，平均年龄58.4±10.8岁。

　　1.2 试剂与仪器 PCR扩增反应体系试剂购自大连宝生物工程有限公司，丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺购自北京鼎国生物技术有限责任公司，引物合成由上海生工公司完成，提取DNA的试剂盒为上海生工生物工程公司产品。主要仪器：PCR仪(The Perkin-Elmer Corporation PE480)，紫外透射反射分析仪(上海康禾光电仪器有限公司)，DYCZ-24D型垂直电泳槽(北京六一仪器厂)，TS-1脱色摇床(金坛市华峰仪器有限公司)。

　　1.3 方法

　　1.3.1 DNA提取 采用上海生工公司生产的SK1342临床样品基因组DNA小量抽提试剂盒提取组织中DNA，作为PCR反应的模板。步骤如下：(1)样品准备：称取25～30mg组织样品，用手术刀切成碎末，并收集至1.5mL离心管中，用200μL TE悬浮;(2)加入400μL Digestion Buffer混匀;(3)加入3μL Proteinase K,混匀，55℃保温3小时，直至组织完全降解，即完全透明，不粘稠。(4)加入260μL无水乙醇，混匀，然后将样品全部转移到套放于2mL收集管内的UNIQ-10柱中;(5)10 000rpm，室温离心1分钟;(6)取下UNIQ-10柱，弃去收集管中的废液，将柱放回收集管中，加入500μL Wash solution,10 000rpm,室温离心1分钟;(7)重复步骤(6)一次;(8)取下UNIQ-10柱，弃去收集管中的全部废液，将柱放回收集管中，10 000rpm,室温离心30秒，以彻底除去残留的Wash Solution;(9)将柱放入新的洁净的1.5mL离心管中，在柱中央加入50μL Elution Buffer,室温放置2分钟：(10)10 000rpm,室温离心1分钟，离心管中的液体即为基因组DNA。样品置于-20℃保存。

　　1.3.2 引物设计和合成 根据文献报道[4，7]，在BRCA1可能存在突变热点的区域，选择该基因第2、11、20外显子合成3对引物，由上海生工生物工程公司合成。第一对引物用于特异性地扩增BRCA1基因序列(GeneBank.L78833)第4557至4814位的258个碱基，引物序列为：上游引物：5′-GAA GTT GTC ATT TTA TAA ACC TTT-3′，下游引物：5′-TGT CTT TTC TTC CCT AGT ATG T-3′。

　　第二对引物用于特异性扩增BRCA1基因序列第36220至36520位的301个碱基，引物序列为：上游引物：5′-TCA ATG TCA CCT GAA AGA GAA ATG G-3′，下游引物：5′-CAG GAT GCT TAC AAT TAC TTC CAG G-3′。

　　第三对引物用于特异性扩增BRCA1基因序列第71518至71918位的401个碱基，引物序列为：上游引物：5′-ATA TGA CGT GTC TGC TCC AC-3′，下游引物：5′-GGG AAT CCA AAT TAC ACA GC-3′。

　　1.3.3 PCR反应体系及条件 总反应体系25μL，内含DNA样品0.1μg，10mmol/L dNTP 0.8μL，10×PCR缓冲液(含Mg2+)2.5μL Taq DNA聚合酶2U，上下游引物终浓度各为0.33μM，双蒸水补足反应体积至25μL。再加入无菌液体石蜡一滴。

　　PCR循环参数：2和20外显子,(1)预变性：95℃，2分钟;(2)变性：94℃，2分钟;(3)退火：55℃，1分钟;(4)延伸：72℃，50秒，共35个循环，末轮循环72℃延伸5分钟。11外显子,(1)预变性：95℃，3分钟;(2)变性：94℃，40秒;(3)退火：62℃，50秒;(4)延伸：72℃，1分钟，共35个循环，末轮循环72℃延伸5分钟。以上反应条件均为我们通过大量实验反复摸索得出的最佳条件。

　　1.3.4 PCR产物鉴定 取6μL PCR扩增产物并加入1μL溴酚蓝载样液，经1.5%含有EB的琼脂糖凝胶电泳鉴定，其余的置于-20℃保存备用。

　　1.3.5 单链构象多态性分析 取PCR扩增产物3μL,加3μL上样液(95%去离子酰胺，4.9% EDTA,0.05%二甲苯青，0.05%溴酚蓝)混匀后，沸水中变性10分钟，冰上骤冷5分钟，然后上样于8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(acrylamide∶bis=29∶1)，在1×TBE缓冲体系中连续电泳，75～80V，3～4小时，直至二甲苯青接近凝胶底部为止。取出凝胶进行银染。

　　1.3.6 银染 凝胶用硝酸银染色[8]，并加以改进，主要步骤如下：用双蒸水漂洗1分钟，在摇床上0.2%AgNO3染色液中轻摇6分钟，再用双蒸水漂洗1分钟，加少量预冷的显影液，轻摇10秒，弃去反应液，加入200mL显影液(2%NaOH,0.04%NaCO3，0.4%甲醛)轻摇，直至背景呈淡黄色，用双蒸水漂洗至条带清晰。

　　1.3.7 设计对照 根据文献提供的185delAG突变序列由大连宝生物工程有限公司合成此序列，与2外显子在相同条件下进行PCR扩增，再对扩增产物进行单链构象多态性分析。　　

      2 结果

　　2.1 PCR扩增 45例散发的胃癌患者BRCA1基因的2、11、20外显子的PCR扩增产物以及人工合成了一段185delAG基因序列的PCR扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶电泳检测均显示单一条带，与对照组的相应片段长度一致，见图2。

　　2.2 SSCP分析结果 将患者与对照组BRCA1基因外显子2、11、20的PCR产物分别进行SSCP分析，与同一胶中正常对照相比，单链DNA带出现泳动移位，多余条带或条带变宽者，视为异常条带。见图3。

　　本实验检测45例无血缘关系的胃癌患者，在患者DNA外显子2的序列中未检测出存在Ashkenazi犹太妇女185delAG突变;在患者DNA外显子20的序列中未检测出存在Ashkenazi犹太妇女5382insC突变;在患者DNA外显子11的序列中未检出在家族性乳腺癌中报道较多的3232A突变为G突变。

　　3 讨论

　　1990年Hall等[3]用连锁分析方法确定了17q21上有某个基因与乳腺癌的发生有关，并将其命名为BRCA1，1994年Miki成功地克隆此基因，自此人们开始对其进行了较深入的研究。BRCA1基因组长约80kb，编码区5 711bp，包括24个外显子，其中22个外显子编码一个含1 863个氨基酸的蛋白质。大量的实验结果表明BRCA1基因为抑癌基因，其抑癌作用可能是通过其蛋白对其它基因的表达及细胞分化、增殖的调控实现的，正常情况下BRCA1对细胞的分化、增殖具有相当强的调控和抑制作用，而且抑制作用与BRCA1蛋白在细胞核中的表达水平呈平行关系;当BRCA1发生基因突变使其蛋白表达结构异常或表达水平下降，致使抑制功能消失或减弱，或者由于其它原因造成BRCA1蛋白合成减少，或者合成后无法进入细胞核发挥其基因调控作用而在胞质中滞留时，即可能使细胞异常分化和过度增殖，从而导致细胞恶变和肿瘤的发生。

　　BRCA1是一个很大的基因，故发生的突变位点多。自BRCA1被克隆后，已发现100多种突变，它们分布于所有22个外显子及多个非表达片段中(内含子及mRNA剪切位点)，包括大多数常见突变类型，如错意突变、无意突变、移框突变、指环区突变及相应于BRCA1转录数量减少/缺失的调整突变。在BRCA1全部突变类型中，以移框突变最为常见(占58%)，86%的突变产生截短蛋白的产物[9]。世界各地的资料所报道的BRCA1突变不尽相同，具有一定的种族地域差异，公认的4个突变热点是：外显子2的185缺失AG;外显子11的1294缺失40;4184缺失4;外显子20的5382插入C;共约占整个胚系突变的28%[10]。

　　BRCA1在遗传性乳腺癌、卵巢癌患者中的突变率最高，为50%～100%，在卵巢癌和/或乳腺癌患者的1～3级亲属中突变携带率约10%～30%，而在普通人群中不到0.1%[11]。家族性乳腺癌、卵巢癌患者具有遗传倾向，BRCA1基因的突变以常染色体显性遗传的方式遗传给子代。目前国外研究表明BRCA1基因与遗传性乳腺癌、卵巢癌的关系密切，但与除乳腺癌和卵巢癌以外的其它癌症的关系仍不能确定。为研究BRCA1基因突变对其它类型癌症风险的影响，英国剑桥大学Douglas F. Easton博士和他的同事分析了11 847名来自有乳腺癌或卵巢癌家族史，且家族成员中至少有一人携带BRCA1突变的家族的人士的病例。研究人员发现，BRCA1基因突变携带者其胰腺癌或子宫癌的患病风险为非携带者的2倍，而宫颈癌的患病风险更是比非携带者高了将近4倍。对于年龄低于65岁的男性而言，BRCA1突变与前列腺癌风险增加有关。来自费城宾夕法尼亚大学的Barbara L. Weber博士和他的同事分析了483名已经临床检查确认属于乳腺癌或卵巢癌高危病人的BRCA1突变携带者的信息，与普通人群相比，携带BRCA1突变的这些妇女患结肠癌的风险为普通人群的2倍，胰腺癌为普通人群的3倍，胃癌4倍，输卵管癌120倍。而对于无乳腺癌、卵巢癌家族史的散发性胃癌的患者，其发病与BRCA1突变的关系目前还没有报道。本实验选择了欧美家系研究结果显示的BRCA1基因的突变热点区域2、11、20外显子，采用PCR-SSCP结合银染的方法对45例无乳腺癌和卵巢癌家族史的散发性胃癌标本进行检测。结果表明胃癌患者BRCA1抑癌基因第2外显子未检测出Ashkenazi犹太妇女185delAG突变，在第20外显子的序列中未检测出Ashkenazi犹太妇女5382insC突变，在外显子11的序列中未检出家族性乳腺癌中报道较多的3232A突变为G突变，因此推测BRCA1抑癌基因突变存在种族或地域差别，美国黑种人与中国黄种人的突变热点不同。由于BRCA1抑癌基因共有24个外显子，而本实验仅检测了其中三个外显子的部分序列，2、11、20上没有发现突变，推测可能不同的人群存在不同的突变部位，中国人群的突变部位可能与欧美家系的突变部位不同，散发性胃癌可能与BRCA1基因第2、11和20外显子的突变无关。

　　目前检测BRCA1突变的方法中免疫组化法、聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)法，虽然操作简单易行，但存在一些技术上的局限性;变性高效液相色谱分析(DHPLC)和基因测序技术，存在着技术投资较大，运行成本较高等问题;此外还有变性梯度凝胶电泳法(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)、异源双链分析(hetero duplex analysis,HA)、荧光标记的错配分析(fluorescent assisted mismatch analysis,FAMA)以及蛋白截断分析(protein truncation test,PTT)等,但是被专利所保护。而PCR-SSCP技术简单、经济，无需特殊试剂和设备，且条带清晰，结果稳定。PCR-SSCP是1989年由Orita等[12]结合PCR反应和单链DNA非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳首先创立的。其基本原理是在变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，DNA单链的迁移率除与DNA链的长短有关外，更主要的是取决于DNA单链所形成的构象。这种构象由DNA单链碱基顺序决定，其稳定性靠分子内局部顺序的相互作用来维持。相同长度的DNA单链因其顺序不同，甚至单个碱基不同，所形成的构象不同，电泳迁移率也就不同。靶DNA中如果含单碱基置换、碱基缺失或插入等改变时，就会因迁移率变化而出现泳动移位。PCR-SSCP分析具有需要样品量少、操作简便、费时较少、高灵敏度等优点，可以检测点突变、插入或缺失突变，适合于多样品的筛选。DNA银染是利用银离子可与核苷酸结合的特性，在碱性环境下甲醛能使银离子还原从而使凝胶中的DNA得以显带的染色法。传统方法采用溴化乙锭(EB)染色，并在紫外灯下观察，虽操作简便，但不能检出少于10ng的DNA分子，而且EB是强烈的诱癌剂并污染环境，与之相比，银染可检测到低至1ng范围的核酸，具有可与同位素相比拟的高灵敏度，无致癌毒性，同时也消除了观测时紫外线对眼睛的伤害。目前，PCR-SSCP分析已被广泛用于癌基因、抑癌基因突变的鉴定、遗传病致病基因分析和基因诊断等领域。

　　SSCP属于凝胶转化实验中的一种[13]，在具有上述诸多优点的同时，也存在一些不足，如：不能检测出所有的变异，特别是当DNA片段大于200kb时;也不能检测出编码以外的变异，敏感性变化大，仅可作为一个初步筛选的手段。

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