MTA对NCM460和结肠癌RKO细胞增殖和凋亡的影响

　　作者：张青松　　作者单位：华北煤炭医学院附属开滦医院普外科，河北 唐山

　　【摘要】目的：探讨甲基硫代腺苷(MTA)对NCM460和结肠癌RKO细胞增殖和凋亡的作用. 方法: 采用MTT比色技术、Hoechst33258染色技术检测MTA对NCM460和RKO细胞增殖和凋亡的影响. 结果: MTA对结肠癌RKO细胞具有明显的抑制增殖和促进凋亡的作用， 该作用强于对结肠正常上皮细胞NCM460细胞的增殖和凋亡的影响. 结论: MTA对RKO细胞具有明显的抗肿瘤活性，对NCM460细胞的毒性较低.

　　【关键词】 甲基硫代腺苷;结肠/细胞学;RKO细胞;结肠肿瘤;细胞凋亡;增殖

　　【Abstract 】 AIM: To study the effects of methylthioadenosine (MTA) on proliferation and apoptosis in NCM460 cells and RKO cells. METHODS: MTT assay and Hoechst33258 staining were used to detect the effects of MTA on proliferation and apoptosis in NCM460 cells and RKO cells. RESULTS: MTA significantly inhibited proliferation and induced the apoptosis of RKO cells, and it had less effects in NCM460 cells. CONCLUSION: The anticancer effects of MTA in RKO cells are very obvious, and it has little toxicity in NCM 460 cells.

　　【Keywords】 methylthioadenosine; colon/cy; RKO; colonic neoplasms; apoptosis; proliferation

　　0引言

　　甲基硫代腺苷(methylthioadenosine, MTA)的生物重要性被人们所认识[1]. 近年来，一些资料表明，MTA能够促进肝脏癌细胞的凋亡，同时能够抑制正常肝细胞的凋亡[2-4]. 国内外文献尚无有关MTA对结肠癌细胞影响的报道. 我们研究MTA对结肠癌RKO细胞和正常结肠细胞系(NCM460)的增殖和调亡的影响，比较这两个细胞系对MTA的敏感性的差别，为寻找一种能提高临床结肠癌治疗效果和毒性小的化学治疗药物提供实验依据.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　结肠癌RKO细胞购自ATCC公司;NCM460细胞及其培养液M3:10TM购自INCell公司;MTA，MTT(噻唑蓝)购自Sigma公司. RKO细胞和NCM460分别用含100 mL/L小牛血清的MEM培养液和M3:10TM培养液培养，药物处理前1 d种植于6孔板中，RKO细胞数约为3.6×105，NCM460细胞数约为5.4×105，置于37℃,50 mL/L CO2培养箱中. MTA用二甲亚砜配成0.5 mmol/L的溶剂.

　　1.2方法

　　实验分为对照组和MTA组. MTA的浓度分别为0.5，1，2及3 mmol/L，处理过程中使每组均含有等量的二甲基亚砜. 每一分组均有7个复孔，其中6份用于MTT检测，3份用于调亡的检测. MTA的作用时间均为16 h.

　　1.2.1细胞增殖检测

　　在细胞被处理16 h后，弃去培养液，加入5 g/L MTT溶液(M0283)100 μL后，再加入新鲜培养液1 mm. 培养箱中放置4 h后，直接加入MTT溶解剂(M0408)1 mm，轻轻震荡使结晶充分溶解，用比色分光仪检测A570 nm和A690 nm，用A570 nm减去A690 nm的背景值，该差值与该组存活细胞数成正比.

　　1.2.2细胞调亡检测在细胞被处理16 h后，向各孔培养液中直接加入固定液2 mm(甲醛和冰醋酸按3∶1新鲜配置)，2 min后吸去培养液和固定液，加入固定液5 mm固定5 min，重复固定1次. 吸去固定液，加入2 mm Hoechst33258染料溶液(10 μg/L)，避光置于4℃冰箱30 min，吸去染液，加入1 mm PBS液体，避光保存于4℃冰箱，待用荧光显微镜检测细胞凋亡. 在荧光显微镜下，当出现细胞核浓染、核碎裂和凋亡小体时确定为凋亡细胞，每一孔均随机观测5个视野(图1，2)，并计算各组凋亡细胞的百分率.

　　统计学处理：采用SPSS11.0统计软件进行方差分析.

　　2结果

　　2.1MTA对细胞增殖的影响与对照组比较，5′MTA 0.5，1，2，3 mmol/L作用16 h后，NCM460细胞存活率分别为(99.6±2.3)%，(101.5±5.0)%，(88.6±1.9)%(P<0.01)，(82.9±1.9)% (P<0.01). 重复5次实验. 说明5′MTA 2 mmol/L以上可以明显抑制NCM460细胞的增殖. 与对照组比较，5′MTA 0.5，1，2，3 mmol/L 作用16 h后，RKO细胞存活率分别为(84.1±4.5)% (P<0.01)，(69.4±5.2)%(P<0.01)，(55.3±3.8)%(P<0.01)，(40.9±3.5)%(P<0.01). 重复5次实验. 说明5′MTA 0.5 mmol/L以上可明显抑制RKO细胞的增殖，这种诱导作用存在剂量依赖关系.

　　2.2MTA对细胞凋亡的影响

　　MTA 0，0.5，1，2，3 mmol/L作用16 h后，NCM460细胞凋亡率分别为(3.5±0.3)%，(4.6±0.6)%，(7.2±1.1)% (P=0.08)，(9.8±1.6)% (P<0.01)，(12.4±1.2)% (P<0.01). 说明MTA 2 mmol/L以上可明显诱导NCM460细胞凋亡(图1). MTA 0，0.5，1，2，3 mmol/L 作用16 h后，Hct116细胞凋亡率分别为(3.3±0.7)%，(11.0±1.4)%(P>0.05)，(20.3±3.0)%(P<0.05)，(30.1±4.1)% (P<0.01)，(39.3±4.4)% (P<0.01). 说明MTA 1 mmol/L以上可明显诱导RKO细胞的凋亡(图2)，这种诱导作用存在剂量依赖关系.

　　3讨论

　　大肠癌不仅发病率高而且易复发和转移，直接影响预后. 因此如何采取有效的治疗措施以降低其死亡率具有特别重要的意义. 由于化疗和放疗对正常组织、器官不可避免地产生损害或毒性作用，常成为增加剂量、提高疗效的主要障碍. 因此，寻找一种高效低毒的化疗辅助药物治疗肿瘤已成为许多学者研究的方向. MTA是 S腺苷蛋氨酸生成多胺过程中的一代谢产物，它对甲基化和多胺的合成具有抑制作用[5-6]. MTA能够促进肝脏癌细胞的凋亡，同时能够抑制正常肝细胞的凋亡. 但目前尚无有关MTA对结肠癌细胞影响的报道. 我们研究MTA对结肠癌RKO细胞和正常结肠上皮细胞NCM细胞的增殖和凋亡的影响，以比较其不同点，以期发现对结肠癌细胞作用明显而对正常结肠上皮细胞影响较小的药物. 本研究表明，MTA对结肠癌RKO细胞具有明显的抑制增殖和促进凋亡的作用，而对结肠正常上皮细胞NCM460细胞的增殖和凋亡的影响则较小. 这一结果提示，MTA可能是一理想的结肠癌辅助化疗的药物，其对正常结肠细胞的毒性低，对结肠癌细胞的毒性强. 这一特点对结肠癌的临床治疗非常有利. 本研究证实MTA通过抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡而发挥抗肿瘤作用. MTA对其他结肠癌细胞系的影响、其对结肠癌RKO和对结肠上皮NCM460细胞作用不同的机制有待于进一步的研究.

　　【参考文献】

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