TIP30在胃癌组织中的表达及其对胃癌血管生成的影响

　　作者：徐忠凯　郑春宁　孙少川　姜永胜　赵东　　作者单位：1山东大学　医学院　(山东　济南　250012) 2山东大学附属济南市中心医院　普外科　(山东　济南　250013)

　　【摘要】目的: 研究Tat作用蛋白30(Tat-interactive protein 30, TIP30)基因在胃癌组织中的表达及其对胃癌血管生成的影响。方法：运用免疫组织化学方法检测52例胃癌组织及47例癌旁正常组织中TIP30蛋白的表达水平，同时检测CD34标记的微血管密度(microvessel density，MVD)。结果: TIP30在胃癌和癌旁正常组织中的阳性率分别为53.8%和85.1%，两者相比较差异有统计学意义(χ2=11.22，P﹤0.01)，TIP30表达水平与患者年龄、性别、病理分化程度及肿瘤大小无关，与有无淋巴结转移及TNM分期有关。胃癌组织和癌旁正常组织中MVD值分别为27.37±2.68和21.87±4.11，两者比较差异有统计学意义(t=7.95，P<0.01)，胃癌组织中TIP30表达阳性者较阴性者MVD值显著降低(t=-3.18，P=0.003)。结论: TIP30在胃癌组织中表达降低，其可能通过抑制胃癌血管生成影响胃癌的发生发展。

　　【关键词】 胃肿瘤•新生血管化, 病理性•Tat作用蛋白30基因

　　【ABSTRACT】 Objective: To investigate the expression of TIP30 in gastric cancer tissues and analyze its impact with angiogenesis. Methods: The expression of TIP30 and CD34-labeled microvessel density(MVD) were measured by immunohistochemical staining in 52 cases of gastric carcinomas and 47cases of Para-cancer tissues. Results: the positive rate of TIP30 was 53.8% and 85.1% in cancerous tissues and para-cancer tissues, there were significant differences between them (χ2= 11.22, P<0.01). The expression of TIP30 in gastric cancer was observed to correlate with lymph node metastasis and TNM stage, but not related with age, sex, cell differentiation and size of carcinoma. The MVD were 27.37±2.68 and 21.87±4.11 in cancerous tissues and para-cancer tissues.There were obvious differences( t= 7.95,P<0.01 ).The MVD in TIP30-positive tissues was much lower than in negative tissues(t=-3.18，P=0.003 ).Conclusions: the expression level of TIP30 decreases obviously in gastric caicinoma. The effect of TIP30 gene for tumor genesis and growth may be partially completed through depression of vessel formation.

　　【KEY WORDS】 Stomach neoplasms•Neovascularization,pathologic•Tat-interactive protein 30

　　Tat作用蛋白30(Tat-interactive protein 30，TIP30/CC3)基因是国外学者Shtivelman等[1]新发现的一种与肿瘤转移抑制有关的基因。已有研究证明，TIP30蛋白本质是一种转录共分子，具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性,可以通过调节RNA聚合酶Ⅱ的活化调节转录, 影响细胞的增殖和分化[2-3]。TIP30蛋白在肺癌、肠癌、乳腺癌及涎腺样囊性癌等肿瘤组织中的表达均较正常组织降低，提示TIP30蛋白与这些肿瘤的发生有关。本研究通过免疫组织化学方法观察TIP30蛋白在胃癌组织中的表达及其与微血管密度(microvessel density，MVD)的关系，探讨TIP30在胃癌发生发展中的作用及其对胃癌血管生成的影响。

　　1　资料与方法

　　1.1　一般资料　收集山东大学附属济南市中心医院普外科2006年5月—2008年3月手术切除的胃癌组织标本共52例，其中男39例，女13例，中位年龄54.5岁。所有患者术前均未接受放疗或化疗，均经病理组织学检查确诊。所有标本术后均按照美国癌症联合委员会(AJCC)2002年制定的胃癌TNM临床分期法进行分期。其中Ⅰ～Ⅱ期20例，Ⅲ～Ⅳ期32例。有淋巴结转移的40例，无淋巴结转移12例。病理组织学分级：高、中分化17例，低分化35例。病理组织学检查皆为腺癌。取距肿瘤组织边缘≥5 cm的癌旁正常组织标本47例作对照。

　　1.2　主要试剂与仪器　TIP30羊抗人单克隆抗体购自Santa Cruz公司，兔抗羊第二抗体购自生物晶美工程有限公司。鼠抗人CD34单克隆抗体和通用型免疫组织化学试剂盒均购自福州迈新公司。OLYMPUS-BX50显微镜为日本OLYMPUS产品，TD2000图文处理系统由北京天地公司提供。

　　1.3　免疫组织化学染色　4% 多聚甲醛固定组织。常规石蜡切片脱蜡至水，3% H2O2室温孵育，医用微波炉高温抗原修复15 min，采用免疫组织化学SP法，血清封闭，分别加入抗TIP30一抗(工作浓度1：100)及CD34一抗、二抗，DAB显色剂显色。所有切片均经苏木精复染，封片。

　　1.4　结果判定　TIP30染色结果根据相关文献[4]制定，以显微镜下观察细胞显色有无及深浅计分：细胞无显色记为0分，浅黄色记为1分，棕黄色记为2分，棕褐色记为3分;按显色细胞的比例计分：显色细胞<10%记为0分，显色细胞10%～30%记为1分，显色细胞31%～60%记为2分，显色细胞>60%记为3分。上述两项分值的乘积﹥2分视为TIP30蛋白表达阳性，≤2分则视为TIP30蛋白表达阴性。

　　CD34标记的组织MVD的测定，按照Weidner等[5]报道的方法，先在低倍镜下(×100)全面观察切片以确定肿瘤内血管密度最高处，再在高倍镜下(×200)观察计数，以肿瘤内任何1个棕色染色的内皮细胞或内皮细胞层作为1个血管，只要结构不相连，其分支机构也作为1个血管计数;管腔直径>8个红细胞，带有肌层的血管不予计数。计数5个视野内的微血管数，取其平均值作为MVD值。

　　1.5　统计学处理　应用SPSS13.0统计数据软件包进行统计学分析，计数资料采用χ2检验，计量资料采用t检验，以α=0.05作为检验标准。

　　2　结果

　　2.1　TIP30蛋白在组织中的表达　TIP30蛋白主要在细胞质及细胞膜中表达，呈棕黄色颗粒状或团块状，在胃癌细胞及正常胃黏膜细胞中均有表达(图1)。52例胃癌组织中28例TIP30蛋白表达阳性，阳性率53.8%，47例癌旁正常组织中40例表达阳性，阳性率85.1%。与正常胃组织相比，TIP30在胃癌中的表达显著降低，两者比较差异有统计学意义(P<0.01)。

　　2.2　TIP30蛋白表达与胃癌临床病理因素的关系　TIP30蛋白表达水平与患者年龄、性别、病理分化程度及肿瘤大小无关，与有无淋巴结转移及TNM临床病理分期有关。

　　2.3　CD34在血管中的表达　CD34主要表达在血管内皮细胞的细胞质，呈棕黄色;胃癌组织中微血管排列紊乱，大小及密度不均，高密度区多位于肿瘤边缘。胃癌组织的MVD值(27.37±2.68)显著高于癌旁正常组织(21.87±4.11)。

　　2.4　胃癌组织中MVD与临床病理因素及TIP30蛋白表达的关系　MVD与肿瘤病理分化程度无关，与临床病理分期相关，与TIP30蛋白表达相关。TIP30蛋白阳性表达组织中的MVD值显著高于阴性者。

　　3　讨论

　　癌症的发生、发展是多因素、多基因共同作用的结果，原癌基因的激活及抑癌基因的失活是细胞恶变的重要生物学机制。TIP30作为一种抑癌基因，最早是1997年shtivelman等[1]用RNA差异显示技术发现的，最初命名为CC3。1998年肖华等[2-3]在研究人类免疫缺陷病毒的体外转录时，发现了一种相对分子质量为30×103的Tat(Transactivator of transcription)结合蛋白(Tat-interactive protein)，命名为TIP30，序列分析发现TIP30与CC3为同一种蛋白。TIP30基因定位于人类第11号染色体，其cDNA序列表明它有一个编码242个氨基酸残基的多肽的开放阅读框。研究发现哺乳动物的TIP30氨基酸序列与线虫、酵母和大肠杆菌的氨基酸序列具有高度的同源性[6]，表明TIP30蛋白在进化上的保守性。

　　TIP30蛋白在人的心、肺、脑、肾、骨骼、肌肉和胰腺等各种组织中广泛表达[7]，而在许多肿瘤组织中表达降低，提示其参与了肿瘤的生成和发展。Jian等[8]认为TIP30蛋白的低表达与乳腺癌的转移有关，且可能成为乳腺癌的一个新的预后指标。张霞等[9]的研究提示在肝癌组织中TIP30的表达也是降低的。

　　本研究发现TIP30蛋白在胃癌组织中的表达显著降低。有淋巴结转移和临床TNM分期较晚的患者的胃癌组织中TIP30降低程度更明显。

　　胃癌的发生、发展及其转移灶的形成与新生血管密切相关。MVD能够反映肿瘤血管的新生化水平，被认为是肿瘤的独立预后指标之一[10]。TIP30蛋白是否通过影响血管生成来实现胃癌的转移呢?本研究通过对CD34标记的MVD进行检测，发现胃癌组织的MVD值较癌旁正常组织显著升高，TNM分期越晚的肿瘤组织中MVD值越高。同时发现，TIP30蛋白表达阳性的胃癌组织的MVD显著低于阴性者，提示TIP30蛋白的高表达能够抑制胃癌新生血管生成。TIP30蛋白对血管生成的抑制作用可能通过调节血管生成调节因子抑制一系列血管刺激因子的表达，同时诱导一系列血管生成抑制因子的表达而实现。Nicamhlaoibh等[11]发现转染了TIP30基因的v-SCLC细胞培养基可以显著抑制人脐血管内皮细胞的增殖。张霞等[12]发现TIP30蛋白表达降低的肝癌组织中VEGF表达升高，从组织学上证实了TIP30蛋白可以抑制VEGF的表达。

　　除了抑制肿瘤血管生成，TIP30基因对肿瘤细胞的抑制作用还可以通过促进肿瘤细胞的凋亡实现。TIP30蛋白的高表达可以上调一系列促凋亡基因的表达，这包括Bcl-2家族的两个重要成员Bad和Bax[13]。Zhang等[14]发现TIP30可能通过上调抑癌基因p53的表达来实现。Xiao等[3]的研究也提示p53基因参与了TIP30介导的信号传导通路。

　　TIP30基因作为新近发现的一种新的抑癌基因，参与了胃癌的发生、发展和血管生成。研究其发挥作用的具体分子通路及表达调控点，可以为胃癌的靶向治疗和抗血管治疗提供一条新的思路，具有重要的临床意义。

　　【参考文献】

　　[1] Shtivelman E. A link between metastasis and resistance to apoptosis of variant small cell lung carcinoma[J]. Oncogene, 1997,14 : 2167-2178.

　　[2] Xiao H, Tao Y, Greenblatt J, et al. A cofactor, TIP30, specifically enhances HIV-1 Tat2 -activated transcription[J]. Proc Natl Acad Sci USA,1998,95: 2146-2151.

　　[3] Xiao H, Palhan V, Yang Y, et al. TIP30 has an intrinsic kinase activity required for up-regulation of a subset of apoptotic genes[J]. EMBO J, 2000, 19:956-963.

　　[4] Mattern J, Koommagi R, VolmM. et al. Biological characterizeation of subgroup of squamous cell lung carcinomas[J]. Clin Cancer Res, 1999, 5:1459-1463.

　　[5] Weidner N, Semple JP, Welch WR, et al. Tumor angiogenesis and metastasis correlation in invasive breast carcinoma [J].New Engl J Med,1991，324:1-8.

　　[6] Shtivelman E. A link between metastasis and resistance to apoptosis of variant small cell lung carcinoma [J]. Oncogene,1997,14:2167-2173.

　　[7] Ito Mitsuhiro, Jiang Chao, Krumm Kristy, et al.TIP30 deficiency increases susceptibility to tumorigenesis[J].Cancer Reseach, 2003,63:8763-8767.

　　[8] Jian Zhao, Haidong Ni, Yunchao Ma, et al. TIP/CC3 expression in breast carcinoma:relation to metastasis,clinicopathologic parameters,and P53 expression.[J]. Human Pathology,2007,38:293-298.

　　[9] 张霞，赵健，王皓，等.TIP30基因在肝癌组织中的表达及意义[J].中华肝胆外科杂志，2004，10(10)：678-714.

　　[10] 席银雪，宋鑫，陈惠新，等.微血管密度在胃癌癌变多阶段组织中的表达及其意义[J].中华医学杂志，2006，86(48)：3405-3408.

　　[11] Nicamhlaoibh Roisin，Shtivelman Emma. Metastasis supressor CC3 inhabits angiogenic Properties of tumor cells in vitro[J].Oncogene，2001，20：270-275.

　　[12] 张霞，陈樟树，欧阳学农.人肝癌组织及肝癌细胞系中TIP30基因与VEGF的关系[J].中国肿瘤临床,2005,32(9):489-492.

　　[13] Shi Mei, Wang Ping, Zhang Xia, et al. Regulation of Bcl-2 family in TIP30-induced apoptosis in hepatoblastoma cells.[J].The Chiniese-German Journal of Clinical Oncology,2005,4(1):11-15.

　　[14] Zhang X, Zhan J , Li XD , et al . Construction of adenovirus vector expressing TIP30 gene and its tumor suppressing effects in vitro and in vivo[J].Chin J Oncol, 2004,26:85-88.