核干细胞因子基因在胃癌、结肠癌和直肠癌组织中的表达

　　作者：王胜,袁志诚,马珪,许文荣　　作者单位：江苏大学　附属人民医院普外科，江苏 镇江212002;基础医学与医学技术学院，江苏 镇江 212013

　　【摘要】目的建立并采用实时定量PCR法检测核干细胞因子(nucleostamin，NS)基因在胃癌、结肠癌和直肠癌组织中的表达，研究该基因在胃肠道癌症诊断中的意义。方法： 构建NS基因和内参基因GAPDH标准品，并采用RTPCR和实时定量 PCR 检测43例胃癌、结肠癌和直肠癌患者肿瘤组织NS基因的表达。结果： RTPCR结果显示NS基因在胃癌组织中的阳性率为90%(27/30)，在直肠癌组织中的阳性率为83.3%(5/6)，在肠癌组织中的阳性率为100%(7/7)。NS基因在胃肠道肿瘤组织中表达上调，表达水平与病理分期未见显著相关性，但表达量与癌组织分化程度显著相关，分化程度较低的癌组织NS表达较高，分化程度较高的癌组织NS表达较低(P<0.05)。结论： NS基因过表达可能在胃肠道肿瘤的发生中起着一定的作用，该基因可能会成为胃肠道肿瘤治疗的靶基因之一，检测该基因的表达有助于胃肠道肿瘤的诊断。

　　【关键词】 核干细胞因子,实时定量 PCR,胃癌,结肠癌,直肠癌

　　[Abstract]Objective: To establish a method of realtime PCR to detect expression of nucleostamin(NS) mRNA, and to analyze its significance in diagnosing alimentary canal cancer.Methods： RTPCR and realtime quantitative PCR were used to investigate the expression of NS in cancer tissues of alimentary canal cancer(43 cases). Results： The results of RTPCR showed that NS was positive in cancer tissues 90%(27/30) of the patients with gastric cancer, 83.3%(5/6) of the patients with carcinoma of rectum and 100%(7/7) of the patients with colon carcinoma. The results of realtime quantitative PCR showed that NS was up regulated in the tissues of gastric cancer , rectum carcinoma and colon carcinoma. The correlation between the expression of NS in cancer tissue and development stage of alimentary canal cancer could not be found, but the expression of NS in cancer tissue was correlated to the differentiation stage of cancer tissue and prognosis of the patients. NS was expressed at a higher level in the earlier stage of differentiation than that in the advanced stage(P<0.05). Conclusion： NS gene may play a role in tumorigenesis and be a novel maker for alimentary canal cancer.

　　[Key words]nucleostamin; realtime quantitative PCR; gastric cancer; colon carcinoma; rectal carcinoma

　　人类核干细胞因子(nucleostemin, NS)基因位于3p21.1, 属于原癌基因，其cDNA全长1 650 bp, 编码一个由549 个氨基酸残基组成的相对分子质量为61.8 ku的蛋白质，对干细胞的增殖和分化有非常重要的意义。该基因的高表达可以阻止干细胞分化，导致永生化[1-4]，从而导致肿瘤的发生。对NS基因在消化道肿瘤组织中表达的研究国内文献报道较少，因此，本研究检测了NS基因在胃癌组织、结直肠癌组织中的表达，并分析该基因与这些疾病的发生关系，现报告如下。

　　1 材料与方法

　　1.1 标本来源

　　收集我院2006年9月至2008年1月住院手术的 43例胃肠道肿瘤患者的癌组织标本。43例患者中，30例为胃癌，男性25例，女性5例，平均年龄59岁。其中16例(男性)有淋巴结转移。6例直肠癌患者，女性3例，平均年龄55岁，男性3例，平均年龄60岁。7例男性结肠癌患者，平均年龄54岁，其中2例有淋巴结转移。诊断均符合病理标准。

　　1.2 试剂

　　RNA提取试剂盒(Invitrogen公司，美国)、RT试剂盒FSK100(Toyobo公司，日本)、PCR试剂盒(TaKaRa，日本)、E.coli DH5α大肠埃希菌、PCR产物纯化试剂盒(Axygen公司，美国)、TA克隆试剂盒(Promega公司，美国)、质粒小提试剂盒(Plasmid Extracion,Axygen公司，美国)、10000×SybrGreen Ⅰ(上海水源生物科技有限公司)，DNA ladder(TaKaRa公司,日本)。

　　1.3 RNA提取及逆转录

　　使用一次性的塑料组织研磨器按照说明书制备组织单个细胞，使用RNA提取试剂盒严格按照操作步骤提取细胞总RNA，使用核酸蛋白检测仪(Eppendorf公司)检测RNA浓度，电泳检测RNA完整性，采用引物Oligo(dT)和RT试剂盒FSK100合成cDNA第一链。

　　1.4 逆转录PCR

　　参照基因库提供的NS基因的mRNA完整序列(序列号为NM 014366)设计NS基因的内侧引物(NSn)，内侧引物可用于RTPCR和实时定量PCR。参考基因库提供的GAPDH mRNA序列(序列号为XR018317)设计内参基因引物(GAPDH)，引物由上海生物工程技术有限公司合成。引物序列见表1。核干细胞因子基因内侧引物(NSn)及GAPDH引物序列，Tab 1 Primer sequences of nucleostemin and GAPDH gene。

　　1.5 实时定量PCR

　　将10000×SybrGreen I稀释4 000倍，取1 μl加入PCR体系，其他试剂参照普通PCR，反应条件为：94℃5 min;94℃30 s，54℃～9℃30 s，72℃ 30 s，72℃采集荧光，35个循环;72℃5 min;熔解曲线范围65℃～9℃。

　　1.6 统计学处理

　　应用SPSS 11.0统计软件进行统计学处理，数据资料采用±s表示，两组间均数比较采用独立样本的t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 RNA提取结果

　　取5 μl RNA溶液，进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后，在紫外灯下观察RNA条带，28S，18S带清晰,示RNA的完整性好。使用ABI公司的核酸蛋白检测仪检测RNA样品的纯度，样品的D(260 nm)/D(280 nm)在1.6～2.0，表明RNA的纯度高。

　　2.2 消化道肿瘤NS基因表达阳性率

　　采用RTPCR检测胃癌、结肠癌、直肠癌患者癌组织中NS基因表达水平。30例胃癌患者中有27例癌组织阳性，癌旁组织阴性，阳性率90%(27/30);2例患者癌组织和癌旁组织都为阴性;1例患者癌组织阴性，但癌旁组织为阳性。16个NS阳性胃癌患者转移淋巴结NS基因有14个阳性，阳性率87.5%，对应的癌组织也为阳性。6例直肠癌患者中有5例患者癌组织NS基因表达阳性,但癌旁组织表达阴性，阳性率80%，另1例癌组织和癌旁组织都为阴性。7例结肠癌患者中有7例患者癌组织为阳性，阳性率100%，癌旁组织为阴性。

　　2.3 消化道肿瘤核干细胞因子基因表达水平

　　采用实时定量PCR检测了30例胃癌患者，6例直肠癌患者和7例结肠癌患者癌组织、癌旁组织及胃癌患者癌旁淋巴结中NS基因的表达。结果显示：胃癌、直肠癌和结肠癌患者癌组织平均表达量高于癌旁组织(P<0.05)，胃癌患者癌旁淋巴结中NS基因表达高于癌旁组织(P<0.05)。

　　2.4 NS基因表达与消化道肿瘤病理分期的关系

　　按照VICC/AlCC(国际抗癌联盟和美国癌症联合会)提出的分期方法，将收集到的消化道肿瘤标本分为3个期，即Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期，结肠癌和直肠癌的Ⅰ期和Ⅱ期合并统计。30例胃癌标本中，Ⅰ期6例，Ⅱ期8例，Ⅲ期16例;7例结肠癌标本中，Ⅱ期4例，Ⅲ 期3例;6例直肠癌中，Ⅰ/Ⅱ期和Ⅲ期各3例。研究结果显示，NS基因在癌组织中的表达水平与病理分期未见显著相关性(P>0.05)。

　　2.5 NS基因表达与肿瘤分化程度的关系

　　在43例消化道肿瘤中，胃癌患者包括高分化、中分化、中低分化、低分化4种，直肠癌和结肠癌包括中低分化和低分化2种。见表2。本研究发现，肿瘤组织分化程度越低，NS基因表达水平越高，见图5，6。表2 消化道肿瘤分化程度，Tab 2 Tumor differentiation of gastrointestinal neoplasms(略)。

　　3 讨论

　　NS基因是维持干细胞和很多肿瘤细胞所必需的生长因子样基因，特异性地表达于干细胞和某些肿瘤细胞的细胞核内[1-5]。该基因表达产物与p53结合并抑制p53的活性，从而促进细胞增殖，并抑制细胞分化。当NS基因表达下调时，可能会导致细胞离开细胞周期而发生分化[1]。钱晖等[6]研究发现，U937(人白血病细胞株)、LTEPa2(人肺癌细胞株)、SW480(人结肠癌细胞株)、PC3(人前列腺癌细胞株)、C6Wt(大鼠胶质瘤细胞株)、UMR106(大鼠骨肉瘤细胞)及Ref52(胎鼠成纤维母细胞)中均表达NS 基因，在突变的人胚胎骨髓间质干细胞中，NS基因呈阳性表达。NS基因在前列腺癌组织以及前列腺癌细胞PC3中高表达，RNA干扰实验[7-10]证明，当NS基因的功能被阻断后，S期细胞的百分率降低, 而G0/G1 期的百分率升高, 细胞的增殖速率明显降低，细胞对裸鼠的致瘤性也显著降低。由于NS在细胞自我更新和分化中显示出的重要作用，本文针对NS与肿瘤分化、分期关系，进一步推断NS在肿瘤发生发展中的关系。

　　本研究通过实时定量PCR法检测NS基因在消化道肿瘤组织中的表达，发现NS基因在胃肠道肿瘤组织中表达上调，NS基因在组织中的表达水平与病理分期未见显著相关性(P>0.05)，但其表达量与癌组织分化程度显著相关，分化程度较低的癌组织NS表达较高，分化程度较高的癌组织NS表达较低。这一结果进一步提示该基因对肿瘤分化调控起着关键作用，因此检测该基因在组织中的表达有助于判断肿瘤的恶性程度。而RTPCR结果显示NS基因在胃癌组织中的阳性率为90%，在直肠癌组织中的阳性率为83.3%，在结肠癌组织中的阳性率为100%。这些结果说明，NS基因可以作为消化道肿瘤的新标志物，使用RTPCR和实时定量PCR检测NS基因的表达可能是诊断消化道肿瘤的较好方法，同时NS基因有可能会成为肿瘤基因治疗的靶基因。

　　【参考文献】

　　[1]Tsai RY, McKay RD. A nucleolar mechanism controlling cell proliferation in stem cells and cancer cells[J]. Genes Dev, 2002, 16(23):2991-3003.

　　[2]Tsai RY,McKay RD. A multistep, GTPdriven mechanism controlling the dynamic cycling of nucleostemin[J]. J Cell Biol, 2005, 168(2):179-184.

　　[3]Baddoo M, Hill K, Wilkinson R, et al. Characterization of mesenchymal stem cells isolated from murine bone marrow by negative selection[J]. J Cell Biochem, 2003, 89(6):1235-1249.

　　[4]Bernatchez R, Belkacemi L, Rassart E, et al. Differential expression of membrane and soluble adenylyl cyclase isoforms in cytotrophoblast cells and syncytiotrophoblasts of human placenta[J]. Placenta, 2003, 24(6):648-657.

　　[5]Chambers I, Colby D, Robertson M, et al. Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells[J]. Cell, 2003, 113(5): 643-655.

　　[6]钱晖, 许文荣, 王文兵, 等. 骨髓间充质干细胞和部分肿瘤细胞中Nucleostemin基因的表达[J]. 中国生物化学与分子生物学报,2005, 21(1):8-13.

　　[7]Liu SJ, Cai ZW, Liu YJ, et al. The effect of knockingdown nucleostemin gene expression on the in vitro proliferation and in vivo tumorigenesis of HeLa cells[J]. J Exp Clin Cancer Res, 2004, 23(3): 529-538.

　　[8]刘思金, 蔡子微, 劳为德,等. NS 特异性siRNA 真核表达载体的构建[J]. 牡丹江医学院学报, 2003, 24(4):1-4.

　　[9]刘思金，蔡子微，胡同法,等. NS基因克隆及人成骨肉瘤细胞和人胚肾细胞NS基因表达[J].牡丹江医学院学报，2003，24(2):5-7.

　　[10]Jafarnejad SM, Mowla SJ, Matin MM. Knockingdown the expression of nucleostemin significantly decreases rate of proliferation of rat bone marrow stromal stem cells in an apparently p53independent manner[J]. Cell Prolif, 2008,41(1):28-35.