EZH2和P16基因在甲状腺乳头状癌中表达的临床意义

　　作者：朱卫东,王鑫,张一兵　　作者单位：河北省唐山市人民医院普外科(朱卫东、王鑫);华北煤炭医学院生理教研室(张一兵)

　　【摘要】目的研究EZH2和P16蛋白在甲状腺癌组织中的表达及意义。方法应用免疫组化SP 法对甲状腺乳头癌50例和甲状腺瘤20 例进行EZH2和P16 检测。结果 EZH2在甲状腺癌的阳性表达率高于甲状腺瘤组织(48.0%与20.0%，P<0.05)，P16在甲状腺癌组织中的表达率低于甲状腺瘤组织(42.0%与75.0%，P<0.05),EZH2和P16的表达与转移、复发有关(P<0.05)，与性别、年龄、肿瘤大小、临床分期无关(P>0.05)。结论 EZH2和P16可能参与了甲状腺癌的发生和发展，对甲状腺癌的进展监测、预后评估有一定临床应用价值。

　　【关键词】 甲状腺癌,EZH2,P16

　　【Abstract】 Objective To investigate the clinical significance of the expression of EZH2 and P16 protein in thyroid papillary carcinoma.Methods Immunohistochemical staining was used to determine the expression of ezh2 and P16 protein in 50 cases of thyroid papillary carcinoma and 20 cases of adenomas.Results The positive rate of expression of EZH2 in thyroid papillary carcinoma was significantly higher than that of adenomas tussue(48% vs 20%,P<0.05),however,the positive rate of expression of P16 in thyroid papillary carcinoma was significantly lower than that of adenomas tussue (42.0% vs 75.0%,P<0.05).The expression of EZH2 and P16 was closely correlated with metastasis and recurrence (P<0.05),however,there was no correlation with patients’age,sex,tumor size and clinical stage(P>0.05).Conclusion The expression of EZH2 and P16 may be involved in the pathogenesis and development of thyroid carcinoma,which is helpful to monitoring the progression and evaluating prognosis in patients with thyroid carcinoma.

　　【Key words】 thyroid neoplasm;EZH2;P16

　　EZH2基因是新发现的一种癌基因，有促进细胞增殖作用[1]。P16蛋白为细胞周期蛋白依赖性激酶4(Cyclindependentinase 4,CDK4)抑制因子。它们都参与了多种恶性肿瘤的发生、发展,但EZH2与P16蛋白在甲状腺乳头状癌表达相关性的研究笔者至今尚未见国内外报道。本研究利用免疫组化技术研究人类甲状腺癌组织石蜡切片中EZH2和P16蛋白的表达及其相关性,从蛋白水平研究EZH2与P16在人类甲状腺癌发生发展及预后中的作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 选择2005年1月至2009年12月河北省唐山市人民医院院普外科手术切除并经病理组织学确诊的乳头状癌标本50例为恶性组织,另取甲状腺瘤20例为对照。复阅上述患者的病理切片,重新切片。

　　1.2 试剂 一抗分别为鼠抗人EZH2单克隆抗体、P16单克隆抗体及免疫组化SP试剂盒为即用型,均为北京中杉生物公司产品。

　　1.3 免疫组化SP法检测EZH2、P16基因表达 石蜡切片经二甲苯脱蜡和乙醇梯度脱水后,PBS冲洗3遍;每张切片滴加3%H2O2,阻断内源性过氧化物酶活性,室温孵育20 min;PBS冲洗3 min×3次;将切片放入pH值7.0 EDTA修复液微波抗原修复15 min，取出切片,自然冷却至室温,PBS缓冲液冲洗2遍;滴加一抗(EZH2 1∶150,P16 1∶50),4℃过夜。阴性对照以PBS代替一抗。PBS冲洗3 min×3次;滴加二抗,37℃孵育30 min,PBS冲洗3 min×3次;切片上滴加新鲜配制的DAB溶液,显色3～5 min,显微镜下,观察胞质和(或)胞核内出现棕黄色颗粒为阳性细胞;自来水冲洗,苏木素复染,中性树胶封片。

　　1.4 阳性结果判断 EZH2及P16基因的阳性表达部位均主要在细胞核,阳性信号呈棕黄色。以阳性细胞占肿瘤细胞总数的比例和染色强度作为判断依据，于高倍镜下随机取10个不同视野，各计数100个细胞观察:无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分;再按阳性细胞所占的百分比评分:阴性为0分，阳性细胞<25%为1分，25%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分，两分值的乘积>3为阳性。

　　1.5 统计学分析 应用SPSS 10.0统计软件，计数资料采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 EZH2和P16蛋白在甲状腺癌及甲状腺瘤组织表达 EZH2在甲状腺癌组织表达高于甲状腺瘤组织(48.0%与20.0%)，差异有统计学意义(P<0.05);P16蛋白在甲状腺癌组织表达低于甲状腺瘤组织(42.0%与75.0%),差异有统计学意义(P<0.05)。见表1、图1～4。表1 甲状腺肿瘤中EZH2及P16基因表达结果比较例(%)

　　2.2 EZH2和P16蛋白表达与甲状腺癌临床参数关系 Ⅰ期甲状腺癌组织中EZH2表达低于Ⅱ～Ⅲ期(36.4%与70.6%)，P16表达高于Ⅱ～Ⅲ期(48.5%与29.4%)，但差异无统计学意义(P>0.05);有淋巴结转移的甲状腺癌组织中EZH2表达高于无淋巴结转移者(59.4%与27.8%)，P16表达低于无淋巴结转移者(31.2与61.1%)，差异有统计学意义(P<0.05);复发甲状腺癌组织中EZH2表达高于无复发者(76.9%与37.8%)，P16表达低于无复发者(15.3%与51.4%)，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

　　3 讨论

　　细胞周期调控机制紊乱导致细胞的失控性生长是恶性肿瘤发生的共同特征，周期蛋白表达异常是导致细胞周期紊乱的重要原因之一[2]。EZH2基因是一个癌基因，属于polycomb基因家族,该基因位于染色体7q35，该基因编码一个746个氨基酸的多肽，含有SET结构域，具有组蛋白甲基转移酶活性[3]。表2 EZH2和P16蛋白的表达与甲状腺癌临床病理参数的关系例(%)

　　EZH2通过染色质修饰调控靶基因转录，作为转录抑制因子阻遏一些抑癌基因表达,使细胞周期抑制物质减少,细胞周期调控机制发生紊乱[4]。EZH2高表达可以促进细胞G1S期转化，使细胞过度增殖减少分化,从而导致恶性肿瘤的发生发展[5]。Raaphorst等[6]报道正常静息期乳上皮细胞EZH2蛋白表达缺失，而在乳腺导管原位癌中EZH2蛋白表达已经开始增加，并表现出浸润征象，将EZH2转染正常永生化乳腺上皮细胞系H16N2后，EZH2蛋白表达增加，结果细胞表现出粘附非依赖性生长和侵袭性等恶性表型。在肝癌、膀胱癌等肿瘤研究中发现肿瘤组织中EZH2表达高于正常组织并与肿瘤的侵袭和转移有关[7,8]。本实验中，我们发现EZH2在甲状腺癌组织中表达高于甲状腺瘤组织，表明甲状腺癌演变过程中存在EZH2的表达上调,而且在发生转移的，甲状腺癌组织中EZH2表达高于没有发生转移的，在复发的甲状腺癌组织中EZH2表达高于没有发生复发的，差异有统计学意义(P<0.05)，提示EZH2蛋白的表达上调与甲状腺恶性肿瘤的形成及淋巴结的转移有关，作为监测肿瘤转移和复发危险性的客观指标，有潜在的临床应用价值。

　　P16基因是抑癌基因,位于人染色体9p21，其编码蛋白是细胞周期监控、驱动机制中最主要的调控蛋白。P16蛋白是CDK4抑制因子,由于CDK4在细胞增殖和恶性转化过程中起重要作用,参与了多种肿瘤的发生或发展,因此P16基因被称为多重肿瘤抑癌基因[9]。当P16基因由于缺失、突变和甲基化导致表达降低时，对CDK4抑制减弱,就会导致细胞无限的增殖、恶变。有文献报道P16表达增加的肺癌细胞被阻滞在G1期,无法进入S期[10]。本实验检测了50例甲状腺癌和20例甲状腺瘤组织，结果显示甲状腺癌组织P16表达低于甲状腺瘤组织，而且发生转移和复发的甲状腺癌组织中P16表达均低于没有转移和没有复发者，与文献报道相符[11]，提示P16的表达降低可能与甲状腺癌的恶性转化有关，检测甲状腺癌组织P16的表达变化对预后评估和病理鉴别诊断有一定指导意义。

　　肿瘤的发生是一个多因素、多步骤的发展过程,是多基因共同作用的结果，EZH2的高表达和P16蛋白低表达与甲状腺癌的发生、发展、浸润、转移有关。联合检测EZH2和P16蛋白表达可以在一定程度上预测甲状腺癌患者的预后，对更好地理解甲状腺癌的恶变机制以及综合评价其对患者预后的影响可能更具临床价值。

　　【参考文献】

　　1 Bachmann IM,Ole J，Colle HK,et al.EZH2 Expression Is Associated With High Proliferation Rate and Aggressive Tumor Subgroups in Cutaneous Melanoma and Cancers of the Endometrium,Prostate,and Breast.Journal of Clinical Oncology,2003,24:268273.

　　2 宋爱林.甲状腺乳头状癌68例临床分析.河北医药，2008，31：1565.

　　3 Chen H,Rossier C,Antonarakis SE.Cloning of a human homolog of the Drosophila enhancer of zeste gene (EZH2) that maps to chromosome21q2212.Genomics,1996,38:3037.

　　4 Varambally S,Dhanasekaran SM,Zhou M,et al.The polycomb group protein EZH2 is involved in progression of prostate cancer.Nature,2002,419:624629.

　　5 Bracken AP,Pasini D,Capra M,et al.EZH2 is downstream of the pRBE2F pathway,essential for proliferation and amplifiedin cancer.Embo J,2003,22:53235335.

　　6 Raaphorst FM,Meijer CJ,Fieret E,et al.Poorly differentiated breast carcinoma is associated with increased expression of human polycomb group EZH2 gene.Neoplasia,2003,5:481488.

　　7 Raman JD,Nigel P，Mongan D,et al.Increased Expression of the Polycomb Group Gene,EZH2,in Transitional Cell Carcinoma of the Bladder.Clin Cancer Res,2005，11:85708576.

　　8 Sudo T,Utsunomiyal T,Mimori1 K,et al.Clinicopathological ignificance of EZH2 mRNA expression in patients with hepatocellular carcinoma.British Journal of Cancer,2005，92：17541758.

　　9 周清华,石应康,侯梅,等.人非小细胞肺癌P16基因突变研究.中国胸心血管外科临床杂志,1997,4:6769.

　　10 Spruck CH,Johnson DG,Schwart JK,et al.P16 gene in uncultured tumours.Nature,1994,370:183184.

　　11 Tung WS,Shevlin DW,Bartsh D,et al.Infrequent CDKN2 mutation in human differentiated thyroid cancers.Mol Carcinology,1996,15:51.