结直肠癌中抑癌基因ING1的研究进展

　　作者：刘家旋(综述) 陈利生(审校) 作者单位：(1 广西医科大学 南宁 530021;2 广西医科大学第一附属医院结直肠肛门外科)

　　【关键词】 结直肠癌 抑癌基因ING1 研究进展

　　肿瘤的发生是一个多基因参与的多步骤的复杂过程，抑癌基因可能是抵御肿瘤发生的重要保护机制。ING1是1996年Garkavtsev等[1]用正常的乳腺上皮细胞株和8个乳腺癌细胞株分离出的一个新基因。这个基因在正常情况下对细胞生长具有抑制作用;而用反义mRNA可以阻断其作用，促进细胞生长和恶性转化，故命名为生长抑制基因(ING)。利用荧光原位杂交技术(FISH)发现，该基因定位于人类染色体13q3334，其cDNA全长2061bp[2]。人类ING1基因包含3个外显子(1a,1b和2)和2个内含子，由3个不同启动子区产生4种mRNA 变异体[3]。其中，p33ING1是主要的翻译产物。p33ING1的表达可抑制细胞生长，调节细胞衰老和诱导细胞凋亡，在细胞周期调节中起负调控作用。在人类许多肿瘤组织中发现存在p33ING1表达降低，并参与部分肿瘤的演进过程。现将最近结直肠癌中抑癌基因ING1的研究进展叙述如下。

　　1 抑癌基因ING1mRNA在结直肠癌中的表达、突变分析及其意义

　　1.1 研究发现p33ING1蛋白表达与结直肠癌的浸润转移有关。韦建宝等[4]利用RTPCR技术检测结直肠癌和相应的正常黏膜组织p33ING1mRNA 的表达，发现所有正常肠黏膜中均能检测出ING1mRNA的表达，在Dukes A/B期的病例中的表达强度明显强于C/D期的病例，癌组织和相应的正常黏膜组织相比则表达明显下降，提示ING1mRNA表达水平的降低与结直肠癌的进展有密切关系。ING1mRNA表达的减低与患者的性别、年龄、肿瘤分化程度、肿瘤部位及浸润深度无关，与肿瘤的Dukes分期及淋巴结转移显著相关。ING1mRNA表达随肿瘤Dukes分期趋向越晚，其相对表达强度越低，差异有显著意义(P<0.01)。在有淋巴结转移的结直肠癌中ING1mRNA相对表达强度明显减弱，与无淋巴结转移组比较差异有显著意义(P<0.01)。

　　1.2 ING1在结直肠癌中突变发生率很低，主要是通过表达水平的降低参与结直肠癌的发生发展。Oki等[5]发现，在HCT116结肠癌细胞系有1处突变，氨基酸序列2处发生改变。12例胃癌细胞中仅2例有沉默突变，但在突变处无氨基酸顺序的改变。Chen等[6]在31例食管鳞细胞癌(ESCC)中也发现6例有ING1突变，其中4例为错义突变。多数抑癌基因主要通过两个方面失活从而促进肿瘤发生：①发生染色体易位或纯合/杂合性缺失;② 基因突变。Sarela等[7] 针对INC1的编码区域设计了四对引物进行PCR—SSCP突变分析，结果在29例结直肠癌中未发现ING1的突变。同时Sarela等关于结直肠癌ING1杂合性缺失的研究发现在结直肠癌中仅检测到l7%(5/29)的病例有存在微卫星不稳定性，29例标本中无1例检测到杂合性缺失，说明在结直肠癌ING1的表达下调并非由于染色体位点的缺失。可能存在其他环节引起基因表达水平的下调，比如近年的研究发现基因启动子位点的过度甲基化与抑癌基因的失活有关[8] ,如P16INK4、E.Cadherin和BRCA1。

　　1.3 定量ING1mRNA的检测不仅有助于显示肿瘤发展的机制，而且为各种肿瘤治疗的效能提供分子生物学上的证据。LIU Bin等[9]利用基于分子信标的定量PCR方法检测在不同基因调节下的ING1mRNA的表达，发现经5Fu处理或ING1转染的MCF7细胞系，ING1mRNA表达水平上调;但在ING1正常表达的CNE2细胞系中，经p53 RNA干扰后则其表达被抑制。这结果表明从定量水平对ING1转录的研究可以进一步发现其在肿瘤发生发展中的作用，而且可进一步研究基因表达调节效应的多基因信号通路。

　　2 结直肠癌中p33ING1蛋白的表达及其意义

　　p33ING1与消化道恶性肿瘤发生发展密切相关[10]。梁君林等[11]应用免疫组化SP法发现p33ING1蛋白在结直肠癌组织及其相应的正常黏膜组织中均有表达，但p33ING1蛋白表达阳性率显著低于相应的正常黏膜组织(P<0.01)。结直肠癌组织的p33ING1表达与年龄、性别、肿瘤部位、组织类型、细胞分化等因素无关(P>0.05)。而与Dukes分期及淋巴结转移情况有关。ING1在Dukes分期较早的A和B期表达明显高于DukesC和D期(P<0.05)，无淋巴结转移组ING1表达阳性率明显高于有淋巴结转移组。说明Dukes分期较早而无淋巴结转移的病例ING1表达较高。在正常黏膜中p33ING蛋白主要表达于衰老的上皮细胞，提示p33ING1蛋白在结肠细胞生长、衰老过程中发挥调控作用。这些实验结果均提示p33ING1低表达与结直肠癌的发生发展密切相关。这与国内、外在食管癌、乳腺癌等研究报道是一致的[6,12,13]。

　　3 ING1与P53和细胞凋亡的关系

　　3.1 ING1的功能缺失或突变将导致不合适的细胞生长周期恶性循环、细胞生长失控和细胞凋亡下调，促使恶性肿瘤形成[14]。研究发现[15]，P33ING1表达下降阻止细胞凋亡，P33ING1的功能缺失可通过减少细胞凋亡来引起肿瘤形成。陈利生等[16]实验结果表明肛管癌细胞凋亡指数明显低于肛管良性病变(P<0.01)。分别检测肛管癌P33ING1与P53和细胞凋亡状况显示，P53阳性表达较阴性者细胞凋亡减少，P33ING1则相反，说明肛管癌P33ING1低表达及P53强表达者细胞增殖活跃，细胞周期停滞于G0/G1期或细胞凋亡均下降。梁君林等[11]实验显示ING1主要表达于衰老的结肠上皮细胞，并且可能参与了正常结肠黏膜的衰老调控。在分期越晚，伴有转移的结直肠癌肿瘤中，ING1蛋白表达水平越低，提示ING1可能通过下调表达，减弱了对结直肠癌细胞的生长抑制和癌细胞的凋亡发生，从而参与结直肠癌的发生发展。

　　3.2 研究证明p53与ING1在功能发挥上具有相互制约，需要两个基因的同时存在才能发挥生长抑制及抗凋亡作用。实验显示，与p53蛋白表达阳性组比较，在p53蛋白阴性的肿瘤组织中ING1蛋白表达亦明显缺失或表达减弱。目前普遍认为p53阴性的肿瘤细胞多数具有野生型p53，在这些肿瘤中虽然具有野生型p53基因，但可能因为ING1的低表达甚至缺失，使得野生型p53抑制肿瘤细胞增殖及促进凋亡的作用不能发挥，从而加快了结直肠癌的发生及发展。新近研究发现[17]，p37ING1蛋白中的PHD结构域与p53相互作用，其被认为是由p53介导的调节细胞生长与凋亡的关键辅助因子。同时此研究显示内源性p37ING1的表达水平抑制野生型p53和p53缺失的成纤维细胞的增殖，而p37ING1缺失的细胞中p53功能不受影响。

　　4 ING1启动子甲基化

　　4.1 在结直肠癌的发生发展过程中，ING1基因启动子的甲基化可能是肿瘤发生发展的一个重要机制。曹云飞等[18]用甲基化特异性PCR方法发现结直肠肿瘤标本的ING1的启动子甲基化发生率明显高于正常对照组的标本。DukesC、D期患者癌组织的甲基化发生率55.6%明显高于DukesA、B期(23.1%)，说明在Dukes分期晚者ING1启动子的甲基化发生率明显高于Dukes分期早者，这提示ING1基因的甲基化与结直肠癌的发生发展有密切关系。文献报道[19]结直肠癌中ING1的mRNA处于低表达状态，推测在结直肠癌中ING1基因的甲基化可能是使mRNA低表达的主要机制之一。甲基化导致ING1基因的不表达，转录水平上的调节，可以被甲基化抑制剂所逆转。这可能为结直肠癌的临床治疗提供一个新的生物治疗靶点。

　　4.2 在肿瘤组织中ING1甲基化表现出明显的性别和年龄差异(P<0.05)，提示结直肠癌中ING1的甲基化不仅和肿瘤的分期有关，而且可由年龄与性别相关的因素调节，可能是结直肠癌发生过程中的早期事件。

　　4.3 研究发现，雌激素可能是结直肠癌的ING1甲基化的性别差异的重要因素。雌激素如何影响结直肠癌中ING1的甲基化的机制仍不清楚。雌激素的分子作用由两类雌激素受体(ERs：ERa and ERβ)所介导。这两类受体的结构、配体亲和力、组织分布不同，因此提示他们有不同的生物学作用[20] 。ERa and ERβ在正常结肠上皮和间质中都有表达[21,22]。ERβ在数量上占有优势，在正常的结肠上皮蛋白质或mRNA水平的表达没有性别差异.但在结肠恶性肿瘤中有性别差异[23～25]。ERβ1和ERβ2的mRNA的表达水平在女性患者的肿瘤组织中明显降低，但在男性患者的肿瘤组织中却没有差异[24]，这提示ERβ在结直肠肿瘤发生中有性别特异性作用的可能。

　　目前对P33ING1的研究虽然取得一定的进展，但ING基因家族其他成员的研究仍未取得太大的突破。随着分子生物学技术的不断发展，P33ING1与其他基因的相关性以及P33ING1在肿瘤组织中表达的增强与缺失等问题将会得到进一步的解答。另外，在国内外尚未报道用蛋白半定量方法Western Blot检测结直肠癌中p33ING1的表达及其与TNM分期的关系，这值得我们进一步研究。如何发挥ING1基因在肿瘤诊断和治疗中的作用也需要继续深入探讨。

　　【参考文献】

　　[1]Garkavtsev I, Kazarov A, Riabowol K, et al. Suppression of the novel growth inhibitor p33ING1 promotes neoplastic transformation [ J ]. Nat Genet, 1996,14(5) :415420.

　　[2]Zeremski M, Horrigan SK, Gudkov AV. Localization of the candidate tumor suppressor gene ING1 to human chromosome 13q34. Somat[J].Cell Mol Genet, 1997,23(3) :233236.

　　[3]Jager D,Stockert E,Chen YT, et al. Cancertestis antigens and ING1 tumor suppressor gene product are breast cancer antigens: Characterization of tissuespecific ING1 transcripts and a homologue gene[J] .Cancer Res, 1999,59(20) :61976204.

　　[4]韦建宝，陈利生，高枫.散发性结直肠癌组织中抑癌基因ING1的突变、杂合性缺失及表达[J].癌症，2005，24(2)：141144.

　　[5]Oki E，Niaehara Y，Tokunaga E，et al.Reduced expression of P33ING1 and the relationship with P53 expression in human gastric cancer[J].Cancer lett，1999，147(12)：157162.

　　[6]Lisheng C，Nagahide M ，Tadashi Y，et al.Genetic alterations of candidate tumor suppressor INGI in humanesophageal squamous cel1 cancer[J].Cancer Res，2001，61(11)：43454349.

　　[7]Sarela AI,Farmery SM,Markham AF,et al.The candidate tumour suppressor gene,ING1,is retained in colorectal carcinomas[J].Eur J Cancer,1999,35:12641267.

　　[8]Esteller M, Silva JM, Dominguez G, et al.Promoter hypermethylation and BRCA1 inactivation in sporadic breast and ovarian tumors[J]. J Natl Cancer Inst,2000 , 2(7):564569.

　　[9]LIU Bin,WANG kemin,XIAO Zhiqiang, et al.Quantitative detection of ING1mRNA under different gene regulation based on molecular beacon[J]. Chinese Science Bulletin,2006,51 (17): 20592064.

　　[10]Nouman GS，Anderson JJ，I unec J，et al.The role of the tumor suppressor p33ING1 b in human neoplasm[J].J Clin Pathol，2003，56(7)：491 496.

　　[11]梁君林，周永淳，陈利生.结直肠癌中抑癌基因ING1的表达及其意义[J].结直肠肛门外科,2006,12(5):270272.

　　[12]陈利生，高 枫，韦建宝.食管癌中候选抑癌基因ING1突变的研究[J].西部医学，2004，16(2)：101104.

　　[13]Nouman GS，Anderson JJ.Downregulation of nuclear expression of the p33(INGlb)inhibitor of growth protein in invasive carcinoma of the breast[J].J Clin Pathol，2003，56 (7)：507511.

　　[14]Helbing CC， Veillete C， Raibowol K， et al.A novel candidate tumor suppressor, INGI， is involved in the regulation of apoptosis[J].Cancer Res，1997,57:12551258.

　　[15]Garkavtsev I，Demedtrick D，Riabowol K.Celular localization and chromosome mapping of a novel candidate tumor suppressor gene (INGI)[J].Cytogenet Cel Genet，1997，76：176178.

　　[16]陈利生,李天煜,曹云飞. P33ING1在肛管癌中的表达及与P53和细胞凋亡的关系[J].中华胃肠外科杂志,2006,4:338341.

　　[17]Andrew H. Coles, Huiling Liang, Zhiqing Zhu,et al. Deletion of p37ING1 in Mice Reveals a P53Independent Role for ING1 in the Suppression of Cell Proliferation, Apoptosis,and Tumorigenesis[J]. Cancer Res, 2007,67(5):20542061.

　　[18]曹云飞,陈利生,高 枫.结直肠中ING1甲基化的性别不一致性研究[J].结直肠肛门外科,2006,12(1):2932.

　　[19]韦建宝，陈利生，高枫.2种不同ING1 mRNA剪接体在大肠癌组织中的表达研究[J].实用癌症杂志，2004,19:259261.

　　[20]Nilsson S,Gustafsson JA.Estrogen receptor action[J].Crit Rev Eukaryot Gene Expr,2002,12(4):237257.

　　[21]Wong NA,Malcomson RD,Jodrell DI,et al.ERbeta isoform expression in colorectal carcinoma:an in vivo and in vitro study of clinicopathological and molecular correlates[J].J Pathol,2005, 207:5360.

　　[22]Taylor AH.AlAzzawi F:Immunolocalisation of oestrogen receptor beta in human tissues[J].J Mol Endocrinol,2000,24:145155.

　　[23]Foley EF,Jazaeri AA,Shupnik MA,et al.Selective loss of estrogen receptor 3in malignant human colon[J].Cancer Res,2000,60:245248.

　　[24]Campbell Thompson M,Lynch IJ,Bhardwaj B.Ex pression of estrogen receptor (ER) subtypes and ERβisoforms in colon cancer[J].Cancer Res,2001,61:632640.

　　[25]Konstantinopoulos PA,Kominea A,Vandoros G,et al:Oestrogen receptor beta (ERβ) is abundantly expressed in normal colonic mucosa,but declines in colon adeno carcinoma paralleling the tumour's dedifferentiation[J].European J Cancer,2003,39:12511258.