乳腺癌患者外周血CK5/6/18阳性细胞的检测及其临床意义

　　作者：金广超　臧益秀　李钧　陈连胜　田斌　王晓 作者单位：1.山东大学医学院　(山东　济南　250012)2.济南市中心医院普外科　(山东　济南　250013)3.济南市中心医院肿瘤科　(山东　济南　250013)

　　【摘要】 目的: 探讨乳腺癌患者外周血细胞角蛋白5/6/18(cytokeratin5/6/18,CK5/6/18)阳性细胞表达水平及其临床意义。方法: 采用流式细胞术检测 56例乳腺癌患者外周血CK5/6/18阳性细胞的表达情况。结果: 56例乳腺癌患者中有26例外周血CK5/6/18细胞表达阳性，阳性率为46.4%，与健康对照人群和乳腺良性疾病患者比较，P<0.05;Ⅲ、Ⅳ期乳腺癌患者外周血中CK5/6/18阳性细胞的表达高于Ⅰ、Ⅱ期乳腺癌患者，P<0.05;ER、PR阳性的患者与阴性患者表达无显著意义(P>0.05)。结论: 乳腺癌患者外周血中CK5/6/18阳性细胞的表达与乳腺癌的分期有关，可作为临床监测和判断预后的参考指标。

　　【关键词】 乳腺肿瘤;细胞角蛋白

　　【ABSTRACT】 Objectives: To investigate the clinical significance of the expression level of cytokeratin5/6/18 positive cells in peripheral blood cells from patients with breast carcinoma. Methods: The expression rates of ck5/6/18 positive cells in peripheral blood cells from 56 patients with breast carcinoma were measured and analyzed by flow cytometry. Results: The expression rates of ck5/6/18 positive cells in peripheral blood cells from 56 patients with breast carcinoma was 46.4% and there was significant differences compared with healthy volunteers and the patients with breast benign diseases. The positive rates increased significantly with the pathological staging and show no significant relationship with the ER and PR. Conclusion: The expression of ck5/6/18 positive cells in peripheral blood cells correlates significantly with the pathological staging of breast carcinoma and it could be an effective signal to clinical monitor and prognosis.

　　【KEY WORDS】 Breast neoplasms· Cytokeratin· Flow cytometry

　　乳腺癌是妇女最常见的恶性肿瘤(31%)，其死亡率呈逐年上升趋势[1]。乳腺癌术后的复发和转移是影响患者预后的主要因素。据统计，常规病理淋巴结转移阴性患者手术后5年病死率仍有20%左右。这就提示我们常规的病理学诊断不能完全适应我们临床对患者预后的评估。患者血循环中存在癌细胞是肿瘤转移和复发的重要基础，因此寻找一种特异、敏感的检测指标来发现肿瘤的微转移是目前临床工作的一个热点。2005年7月~2006年6月，我们采用流式细胞术对56例乳腺癌患者外周血细胞角蛋白5/6/18(cytokeratin5/6/18,CK5/6/18)阳性细胞进行了检测，现报告如下并分析其临床意义。

　　1　资料与方法

　　1.1　临床资料　56例乳腺癌患者均为我院住院患者，均为女性，年龄31～76岁，中位年龄49岁。分别于手术前1周内取静脉血2ml,抽血前未行任何的放化疗治疗，所有病例均按照美国癌症联合委员会(AJCC)乳腺癌TNM分期进行临床分期， 均经病理证实，其中浸润性导管癌47例，导管内癌、髓样癌等其他类型肿瘤9例。Ⅰ~Ⅱ期45例，Ⅲ~Ⅳ期11例。另选良性对照24例，为良性乳腺疾病(乳腺增生症、导管内乳头状瘤、乳腺纤维腺瘤)患者，均经病理证实，取我院同期健康查体者20例作为正常对照。

　　1.2　主要仪器和试剂 CK5/6/18鼠抗人单克隆抗体由晶美生物工程有限公司提供，为英国NOVOCASTRA公司产品。FACSCalibur流式细胞仪为BD公司产品，氩离子激光器功率为15MW,激发光波长为488nm。

　　1.3　检测方法　取患者术前外周静脉血2ml，用EDTA抗凝，样品在4℃冰箱中保存，24h以内处理。用PBS2ml将抗凝血稀释1倍后，加入到淋巴细胞分离液4ml中，离心后将单个核细胞层吸出，用PBS洗2遍，先加入0.5ml固定剂，室温下孵育20min后，再加入1.5ml破膜剂，混匀，室温下孵育15min，离心后加入2mlPBS液，分成2管，其中一管为试验管，另一管为阴性对照管。试验管加入CK5/6/18鼠抗人单克隆抗体5μl,低速混匀，室温孵育30min，加PBS2ml,离心后弃上清，试验管和对照管分别加入荧光二抗5μl,低速混匀，室温下避光20min，加入PBS2ml,离心后弃去上清液，加1%多聚甲醛0.5ml,低速混匀，放置于4℃冰箱避光保存，隔夜上机检测。每例样本在流式细胞仪上用仪器配置的CellQuest软件获取3×105个细胞， 用每105个细胞中CK5/6/18阳性细胞数来表示外周血中的肿瘤细胞数。未检测到肿瘤细胞的为阴性，反之则为阳性。

　　1.4　统计学处理　应用SPSS10.0统计软件。计量资料采用成组设计资料的t检验，计数资料采用χ2 检验。α=0.05。

　　2　结果

　　2.1　乳腺癌患者外周血CK5/6/18阳性细胞的表达率　乳腺癌患者外周血CK5/6/18阳性细胞的表达(12.82±6.91)显著高于良性对照组与正常对照组(均无阳性细胞表达) P均<0.05;良性对照与正常对照者相比，P>0.05。

　　2.2　乳腺癌患者外周血CK5/6/18阳性细胞的表达率与临床相关参数的关系 乳腺癌患者外周血CK5/6/18阳性细胞的表达率与患者的年龄、是否绝经、ER和PR的表达无明显相关(P>0.05)，而与肿瘤的大小、腋窝淋巴结情况、TNM分期明显相关(P<0.05)。见表1。

　　3　讨论

　　乳腺癌术后的复发和转移是影响患者预后的主要因素，而常规病理学诊断不能完全适应临床对患者预后的评估，相应的提出了循环肿瘤细胞及微转移(micrometastases)的概念。广义的微转移指恶性肿瘤在发展的过程中播散并存活于外周血、骨髓、淋巴管以及各组织器官中的肿瘤细胞，这些细胞尚未形成转移结节，或结节直径≤2mm，通常无任何临床表现，常规检查方法如影像、常规病理检查等难以发现[2]。

　　流式细胞术是利用抗肿瘤细胞的单克隆抗体结合荧光物质使肿瘤细胞染色，然后通过流式细胞仪筛选，以得到阳性荧光染色细胞。优点是对整个组织进行分析，而不仅对数个切片进行分析，从而提高了检测的敏感度，且快速、准确。Borgen等[3]认为该法的敏感性可达到1/500 000。Leers采用多参数流式细胞法对乳腺癌前哨淋巴结检测发现，其敏感性及特异性均优于常规病理切片[4]。

　　CKs 来源于上皮组织，是真核细胞的细胞骨架中间丝蛋白(intermediatefilament protein)中最为复杂的一类。现在已知CK家族由分子量不等的20个成员组成，即CK1～CK20。CKs一般在上皮组织中成对表达，特异性强。CKs的阳性表达已经成为上皮细胞及其肿瘤细胞较为敏感和特异的指标。其中用于乳腺癌研究较多的为CK19。Brown等[5]在非上皮组织中分别检测了CK8、CK18、CK19的mRNA,结果显示，在广泛的不同种类非上皮组织中均有CK8和CK18的表达，而CK19表达阴性。说明CK19在上皮组织中的表达最为特异。同时亦表明，既然CK不在正常造血组织中表达，如果在乳腺癌患者的外周血中检测出CK的基因转录物，即可说明有乳腺癌细胞的存在。

　　本研究中56例乳腺癌患者外周血CK阳性细胞的表达(12.82±6.91)显著高于良性乳腺疾病患者和健康对照者, P<0.05，这说明乳腺癌患者外周血中确实存在恶性肿瘤细胞。早期研究认为，微转移对患者的生存无任何不利影响，这些小的细胞巢无临床意义。随着研究的不断深入，原有的观点难以立足。有实验表明[6]将乳腺癌患者骨髓微转移的肿瘤细胞分离出来于体外培养，结果其可以形成克隆，接种裸鼠亦可形成肿瘤，提示临床检测乳腺癌微转移对预测复发和转移可能具有重要意义。以前检测癌细胞CK 大多采用RT-PCR 、免疫组化方法,采用流式细胞术的报道少见[7]。本文结果提示,流式细胞术测乳腺癌患者外周血中CK5/6/18阳性细胞表达水平方法简便、客观性强、便于反复对比研究,而进一步通过大样本的研究和ROC 曲线分析,找出提示癌转移的可靠临界值,可为乳腺癌的诊断、恶性度判断、转移与否及预后判断提供参考依据。目前存在的问题是外周血中尚未发现乳腺癌特异性标志物，所以在乳腺癌微转移的深入研究中，一方面改进实验条件，寻求特异性和敏感性更高的肿瘤标志物。另一方面亦可以采用多基因标志物联合检测，并采用统一的检测方法，扩大样本量并进行长期随访，以进一步阐明乳腺癌微转移的临床意义。

　　【参考文献】

　　[1] Parker SL, Tong T, Bolden S, et al. Cancer statistics, 1996[J]. CA Cancer J Clin, 1996,46(1):5-27.

　　[2] Hermanek P. Disseminated tumor cells versus micrometastasis:definitions and problems[J]. Anticancer Res, 1999,19(4A):2771-2774.

　　[3] Borgen E, Beiske K, Trachsel S, et al. Immunocytochemical detection of isolated epithelial cells in bone marrow: non-specific staining and contribution by plasma cells directly reactive to alkaline phosphatase[J]. J Pathol, 1998,185(4):427-434.

　　[4] 王建中. 临床流式细胞分析[M]. 上海：上海科学技术出版社， 2004:459-490.

　　[5] Brown DC, Purushotham AD, Birnie GD, et al. Detection of intraoperative tumor cell dissemination in patients with breast cancer by use of reverse transcription and polymerase chain reaction[J]. Surgery, 1995,117(1):95-101.

　　[6] Cote RJ, Rosen PP, Lesser ML, et al. Prediction of early relapse in patients with operable breast cancer by detection of occult bone marrow micrometastases[J]. J clin Oncol, 1991,9(10):1749-1756.

　　[7] Güdemann CJ, Weitz J, Kienle P, et al. Detection of hematogenous micrometastasis in patients with transitional cell carcinoma[J]. J Urol, 2000,164(2):532-536.