HGF非融合蛋白真核表达载体的构建及其在骨骼肌细胞中的表达

　　作者：郭亮，陈剑秋，孙晋津，陈传贵 作者单位：解放军军事交通学院 卫生处，天津 300161;天津医科大学第二医院 外科，天津 300211

　　【摘要】 目的 构建以HGF为目的基因、以EGFP为报告基因的非融合蛋白真核表达载体pCMVHGFIRESEGFP，并观察HGF基因在原代培养的大鼠骨骼肌细胞中的表达。方法 利用BamH I单酶切质粒pcDNA3HGF，得到HGF基因片段，将其正向插入到真核表达载体pCMVIRESEGFP的CMV后方BamH I的单克隆位点。脂质体介导转染至原代培养的大鼠骨骼肌细胞，在荧光显微镜下观察EGFP的表达，并用ELISA法检测HGF的表达情况。结果 构建了HGF的非融合蛋白真核表达载体pCMVHGFIRESEGFP，转染原代培养的大鼠骨骼肌细胞24~72 h 后，见30%的细胞表达EGFP。ELISA检测细胞培养液证实转染后第1天即有HGF的表达，第4天HGF浓度为(5 402.0±227.9 )ng/L。结论 成功构建了非融合蛋白真核表达载体pCMVHGFIRESEGFP，其在原代培养的大鼠骨骼肌细胞中能有效表达。

　　【关键词】 肝细胞生长因子;细胞转染;骨骼肌细胞

　　肝细胞生长因子(hepatocyte Growth Factor，HGF)有多种生物学作用[1,2]，它能够促进肝细胞、多种上皮细胞和内皮细胞的生长。pIRES2EGFP为CLONTECH公司推出的一个较理想的基因共表达载体，文献报道其筛选效率最高达100%[3]。本研究构建了pCMVHGFIRESEGFP表达载体，并对其在原代培养的鼠骨骼肌细胞中的表达情况进行了检测。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 质粒pcDNA3HGF，plRES2EGFP由天津医科大学第二医院外科实验室保存;T4DNA连接酶、限制性内切酶、质粒提取、纯化及胶回收试剂盒、DNA Marke购自TaKaRa公司;质粒测序由TaKaRa公司完成;LipofectamineTM2000及所有细胞培养试剂均购自Gibco公司;原代培养的大鼠骨骼肌细胞由本室培养;HGF的ELISA试剂盒购自武汉博士德。

　　1.2 方法

　　1.2.1 pCMVHGFIRESEGFP的构建 根据真核表达质粒pcDNA3HGF酶切位点图谱，用限制性内切酶BamH I对pcDNA3HGF单酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切取含有目的片段HGF的凝胶并进行胶回收(图1)。回收的目的片段HGF与经BamH I酶切、去磷酸化处理的pIRES2EGFP在室温下利用T4DNA连接酶连接1 h，将连接体系转化人感受态大肠埃希菌DH5a后，接种于含卡那霉素的LB平板上，37 ℃ 培养过夜，选择阳性克隆培养后小提质粒，用BamH I单酶切分析转化的重组质粒，琼脂糖电泳，紫外透射反射检测仪上观察酶切结果。将含有pCMVHGFIRESEGFP的DH5a菌株扩大培养，提取质粒，所有操作方法均按试剂盒说明书进行。提取的质粒进行酶切、测序鉴定。

　　1.2.2 细胞转染 转染过程按照lipofectamineTM2000转染试剂盒说明书进行。用含10%胎牛血清的DMEM完全培养基培养骨骼肌细胞。将对数增长期的原代骨骼肌细胞于转染前24 h 用0.25%的胰蛋白酶进行消化。按每孔2×105个细胞的密度接种于24孔培养板中，当细胞达到90%~95%融合时，用无血清DMEM培养基洗涤，于每孔转染细胞中加入预先配制好的lipofectamineTM2000：质粒pCMVHGFIRESEGFPO 1 ml，再加0.5 ml 无血清的RPMI 1640培养基，轻轻混匀后在37 ℃ 恒温培养箱(5%CO2)中进行培养。分别于24，48，72 h 在荧光显微镜下观察EGFP的表达。

　　1.2.3 ELISA法检测HGF蛋白表达水平 分别于转染后24，48，72，96 h 收集各培养孔中的培养上清液，按照HGF的ELISA试剂盒说明书测定标准品及各孔培养上清液中HGF蛋白含量。

　　2 结果

　　2.1 重组质粒pCMVHGFIRESEGFlP的酶切、测序鉴定 重组质粒pCMVHGFIRESEGFP经BamH I单酶切琼脂糖电泳后，紫外透射反射检测仪上可见一条2.3 kbp 的目的片段和5.3 kbp 的载体片段(图2)，与预测结果相符，表明HGF已被插入到pIRES2EGFP中。将提取质粒送TaKaRa公司全长测序，测序结果与Genbank提供的HGF序列完全一致，方向正确，此序列含有HGF cDNA全长序列的-27~2 246处碱基。

　　2.2 细胞转染后EGFP的表达 重组质粒pCMVHGFIRESEGFP转染原代培养的大鼠骨骼肌细胞后24~72 h，在荧光显微镜下观察，可发现30%细胞表达EGFP，表现为细胞发出明亮的绿色荧光(图3)。未转染pCMVHGFIRESEGFP及转染空载质粒pIRES2EGFP的对照组骨骼肌细胞未见绿色荧光。

　　2.3 ELISA检测HGF的表达 根据标准品的浓度及相应的0D值做曲线拟合，绘制标准曲线并求出回归方程：y=0.105+0.000 502x(R2=0.995 3，P=0.000 1)。将各组收集的培养上清液作ELISA检测，所得0D值带入回归方程，计算出相应的HGF浓度。结果显示，pCMVHGFIRESEGFP转染后的第1天即有HGF蛋白表达，为(656.3±170.5)ng/L，第2天为(1 192.5±125.8)ng/L，第3天为(2 624.5±140.8)ng/L，第4天为(5 402.0±227.9)ng/L(图4);而转染pIRES2EGFP和未转染质粒组的细胞培养上清液中均未检测出HGF的表达。

　　3 讨论

　　HGF对肝细胞有促分裂和增殖作用，近年发现它的特异性受体cmet也存在于血管内皮细胞和心肌细胞中，这其中促血管生成作用尤其重要。HGF的促血管生成作用表现在促血管内皮细胞分裂和增殖、促迁移、抗凋亡和促管样结构形成[4]，而这些作用主要是通过上调必需转录因子(Ets1)实现的[5]，而Ets家族成员在调控针对发育和细胞分裂的信号应答的基因表达上起着非常重要的作用[6~7]。

　　本研究利用基因重组技术构建真核表达载体质粒pCMVHGFIRESEGFF，所用载体pIRES2EGFP中的IRES序列的直接作用就是从一条多顺反子mRNA上翻译两个目的蛋白，并允许单启子启动两个目的基因同时表达，保证了其连接的非相关基因各自独立的表达，能极大地提高转染基因共表达效率。此功能已在众多实验中得以上证实。pIRES2EGFP可以用于快速筛选经瞬时转染表达EGFP和目的蛋白的真核细胞，也可用于单独表达EGFP或获得稳定转染的细胞系。报告基因EGFP是野生型绿色荧光蛋白GFP的变异体，与GFP相比，它的荧光强度更强，在真核细胞中表达量更高。利用该载体可以在荧光显微镜下直接观察到EGFP和目的蛋白的表达。本实验通过脂质体介导，将表达质粒转染入原代培养的骨骼肌细胞中。在荧光显微镜下可观察到发出绿色荧光的细胞，ELISA检测转染了质粒的细胞培养液，可观测到HGF蛋白的分泌，而未转染质粒的细胞培养液和转染空载质粒plRES2EGFP的细胞培养液，均未检测HGF蛋白的分泌。由此证实了质粒中HGFcDNA及EGFP均发挥了生物学效应，得到了表达。通过本研究，成功构建了含有HGF真核表达载体pCMVHGFIRESEGFP，并能够有效转入骨骼肌细胞中。HGF及EGFP有效表达，为进一步研究其生物学活性及体内外实验奠定了基础。

　　【参考文献】

　　[1] Nakamura T,Nishizawa T,Hagiya M,et al.Molecular cloning and expressionof human hepatocyte growth factor[J].Nature,1989,342(6248):440-443.

　　[2] Noji S,Tashiro K,Koyam E,et al.Expression of hepatocyte gowth factor gene in endothelied and kupffer cells of demaged rat livers,as revealed by situ hybridization[J]. Biochem Biophys Ires Commun,1990,173(1):42-47.

　　[3] Rees S,Coote J,Stables J,et al.Bicistronic vector for the creation of stable mammalian cell lines that predisposes all antibioticresistant cells to express recombinant protein[J].Biotechniques,1996,20(1):102.

　　[4] Kei Y,Ryuichi,Morishita,et al.Contribution of Bc1-2,but Not BclxL and Bax,to antiapoptotic actions of hepatocyte growth factor in hHypoxiaconditioned human endothelial cells[J].Hypertension,2001,37:1341-1348.

　　[5] Iwasaka C,Tanaka K,Abe M,et al.Ets1 regulates angiogenesis by inducing the expression of urokinasetype plasminogen activator and matrix metalloproteinase1 and the migration of vascular endothelial cells[J].J Cell Physiol,1996,169:522-531.

　　[6] Risau W,Flamme I.Vasculogenesis[J].Annu Rev Cell Dev Biol,1995,11:73-91.