α连接素在胃癌转移淋巴结中再表达机制的研究

　　作者：刘津 宋子军 张国建 薛平 段国强 赵琪 李晓宁 王凤安 作者单位：050000 石家庄市，河北医科大学第二医院胃肠外科

　　【摘要】 目的 探讨α连接素(αcatenin) 在进展期胃癌转移淋巴结内癌细胞的再表达情况及其临床意义。方法 采用免疫组化、蛋白印记等方法检测30例胃癌患者胃癌原发灶和转移淋巴结中α连接素蛋白表达情况。结果 在30例胃癌原发灶中100%(30/30)α连接素表达程度减低, 胃癌转移淋巴结中50%(15/30)再表达阳性,其中高分化腺癌的再表达阳性率为71.42%(10/14);中低分化腺癌的再表达阳性率为31.25%(5/16)。高分化腺癌相对于中低分化腺癌更易出现α连接素的再表达阳性,两者比较差异具有统计学意义(P<0.05)。30例原发肿瘤组织及相应转移淋巴结均检测到不同程度的α连接素蛋白表达。 原发癌组织中的各例蛋白相对强度为11～170，平均105±42,转移癌淋巴结组织中各例蛋白相对强度为8～112，平均40±28，原发癌组织中α连接素蛋白表达相对强度高于转移淋巴结组织。在转移淋巴结中高分化腺癌蛋白表达相对强度为25～112，平均54±33，中低分化腺癌的蛋白表达相对强度为8～55，平均27±12。两者间蛋白表达相对强度差异具有统计学意义(P<0.01)。结论 胃癌转移淋巴结内癌细胞是存在α连接素的再表达的,其蛋白再表达水平与肿瘤分化程度相关,并且对癌细胞在转移灶内聚集再生长起着重要作用。

　　【关键词】 胃癌;淋巴转移;免疫组化;蛋白印记;再表达

　　Study on the mechanism of reexpression of αcatenin in lymph nodes of metastatic advanced gastric cancer LIU Jin, SONG Zijun, ZHANG Guojian, et al. Department of Stomach Intestine Surgery, The Second Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050000

　　【Abstract】 Objective To investigate the significance of reexpression of αcatenin in lymph nodes of advanced gastric cancer metastases.Methods The expression of αcatenin was detected in 30 patients with gastric cancer by immunohistochemistry and protein imprinting.Results The expression of αcatenin in primary focus of 30 patients was decreased(100%), while which was positive(50%) in metastatic advanced gastric cancer, in which the positive rate in welldifferentiated adenocarcinoma was 71.42% (10/14), which was 31.25% (5/16) in poorly differentiated adenocarcinoma. Compared with poorly differentiated adenocarcinoma,the welldifferentiated adenocarcinoma was apt to positive of αcatenin expression, there was a significant difference bewteen the two different differentiated adenocarcinoma(P<0.05). The positive expression of αcatenin was found both in primary tumor tissue and corresponding metastatic lymph nodes. The relative intensity of protein in primary carcinoma was 11～170 (mean 105±42), which in lymph nodes of metastatic cancer was 8～112 (40±28), the relative intensity of expression of αcatenin in primary carcinoma was higher than that of metastatic lymph node. The relative intensity of expression of αcateninIn in welldifferentiated adenocarcinoma of metastatic lymph nodes was 25～112 (mean 54±33), which was 8～55 (mean 27±12) in poorly differentiated adenocarcinoma. There was a significant difference in relative intensity of expression of αcatenin between the two different differentiated adenocarcinoma.Conclusion The reexpression of αcatenin exists in lymph nodes of metastatic advanced gastric cancer, and the reexpresion levels are related with the extent of tumor differentiation, furthermore, which plays an important role in gathering and growth of cancer cells in metastatic focus.

　　【Key words】 gastric cancer; lymphatic metastases; immunohistochemistry; Western blot; reexpression

　　研究证明细胞黏附功能下降是恶性肿瘤进展的关键因素。介导上皮细胞黏附的最主要分子是钙依赖性上皮细胞黏附分子E钙黏蛋白(ECAD)[1]。ECAD功能的发挥还需要与其配体连接素(catenin)结合成复合体。该复合体中的α连接素对其有独立的调控作用。有研究表明α连接素可能是胃癌发生浸润转移过程中的早期事件[2]。本研究通过免疫组化、蛋白印记联合检测α连接素在转移淋巴结内癌细胞中的蛋白表达情况，以期探讨α连接素在胃癌转移淋巴结组织中再表达的意义。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 收集2007年3月至2008年3月，河北医科大学第二医院30例胃癌患者的胃癌原发灶新鲜手术标本及其转移淋巴结。其中男19例，女11例;年龄39～83岁，平均年龄60岁。全部病例术前均未经化疗或放疗。所有标本均经液氮处理后置于-80℃低温冰箱中保存。每份标本除部分经常规固定脱水后石蜡包埋切片外，其余部分则分别提取蛋白质。

　　1.2 方法

　　1.2.1 免疫组织化学染色：标本经常规石蜡包埋切片后，采用SP方法进行免疫组织化学染色。第一抗体α连接素为兔抗人α连接素单克隆抗体(NEWMARKER公司)，抗体工作浓度1∶750;SP试剂盒购自北京中山科技公司，按说明书操作。原发灶切片内非癌性胃黏膜细胞作为内部阳性对照。染色完成后在光镜下观察结果，α连接素位于细胞膜。染色结果评价，通过苏木素伊红(HE) 染色确认原发灶和转移淋巴结内癌细胞,如癌细胞染色情况与临近非癌性黏膜细胞相近,且没有胞浆染色情况出现,则被评定为正常染色;如染色不连续,明显减弱或缺失,或出现胞浆染色情况,则被评定为不正常染色。每张切片按其全部癌细胞中出现正常染色细胞的百分率评定为三级:1级为0～50%,2级为51%～80%,3级为81%～100%[3]。原发灶中α连接素3级染色则被认为正常表达;1 级和2 级染色被认为不正常表达;转移淋巴结中如α连接素染色等级高于其原发灶中,则被评定为再表达阳性。

　　1.2.2 蛋白印记分析：将组织粉碎后加入裂解液(北京普利来公司)。蛋白提取过程按照说明书操作进行。在提取出的蛋白中加入5%聚丙烯酰胺凝胶煮沸10 min，12 000转离心10 min，提取上清液。测定各样本蛋白含量，计算等量蛋白质加入SDS聚丙烯酰胺凝胶中，加入电泳液电泳。约3 h后，将凝胶中的蛋白转移到PVDF膜上。用5%脱脂奶粉浸泡转移膜1 h，以封闭非特异性蛋白结合位点。 采用的α连接素抗体种类和工作浓度与免疫组化染色所用抗体相同，第二抗体为辣根过氧化物酶标记的抗兔IgG(北京博奥森公司)，工作浓度为1∶1 000。采用ECL化学发光法检测蛋白含量。于暗室中用胶片显影、定影，采用分析软件Optimas 6.0比较各个样本蛋白条带的显影强度，以显影相对强度(relative intensity)作为蛋白表达的计量标准。

　　2 结果

　　2.1 病理组织学分型及免疫组织化学染色分析 胃癌30例中高分化腺癌14例，中低分化腺癌16例;管状及乳头状腺癌18例，黏液腺癌12例。各例淋巴结转移癌组织的病理学类型与原发灶基本相同。全部30例胃癌原发灶均为不正常表达。14例高分化腺癌中1级染色10例，2级染色4例;16例中低分化腺癌染色1级染色15例，2级染色1例。18例管状及乳头状腺癌中1级染色13例，2级染色5例，12例黏液腺癌染色均为1级。α连接素的再表达阳性率为50%(15/30)(图1)。其中高分化腺癌的再表达阳性率为71.4%(10/14)。中低分化腺癌的再表达阳性率为31.3%(5/16)。高分化腺癌较中低分化腺癌更易出现α连接素的再表达(P<0.05)。管状及乳头状腺癌再表达阳性率为61.1%(11/18)，黏液腺癌的再表达阳性率为33.3%(4/12)。再表达情况差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。表1 α连接素在胃癌转移淋巴结中的再表达及其与临床病理因素的关系例

　　2.2 蛋白印迹分析 30例原发肿瘤组织及相应转移淋巴结均检测到不同程度的α连接素蛋白表达。通过Optimas 6.0蛋白印记分析软件对所有病例的蛋白条带进行分析后发现,原发癌组织中的各例蛋白相对强度为11～170，平均105±42,转移癌淋巴结组织中各例蛋白相对强度为8～112，平均40±28，原发癌组织中α连接素蛋白表达相对强度高于转移淋巴结组织。在转移淋巴结中,高分化腺癌蛋白表达相对强度为25～112，平均54±33，中低分化腺癌的蛋白表达相对强度为8～55，平均27±12。两者间蛋白表达相对强度差异具有统计学意义(P<0.01) (图2),免疫组化染色中再表达阳性的转移淋巴结α连接素蛋白表达相对强度为25～105，平均44±25,再表达阴性的转移淋巴结α连接素蛋白表达相对强度为8～112，平均36±30,两者之间蛋白表达相对强度差异无统计学意义(P>0.05)。

　　3 讨论

　　胃癌是一种多因素多步骤演进的疾病,近年来的一些研究表明[4],α连接素在原发灶的不正常表达对于上皮源性恶性肿瘤,特别是在胃癌的发生发展中起着重要的促进作用。ECAD介导的黏附系统已被公认为浸润抑制系统，且ECAD基因已被公认为抑癌基因。当ECAD表达下调或功能障碍将使同种细胞失去黏附;而对于上皮性肿瘤则意味肿瘤细胞具备侵袭性生长的特点并容易从原发灶脱落分离向局部淋巴结转移或远处转移。ECAD黏附功能的发挥还要受其配体α连接素调节。α连接素对于维持正常上皮组织的结构有着至关重要的作用。多项研究表明,胃癌、乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、肺癌中广泛存在α连接素蛋白表达异常,并与肿瘤的分化、侵袭、转移和预后具有相关性[5-7]。对于上皮源性恶性肿瘤来说,在某些原因作用下发生α连接素功能障碍会影响癌细胞间的黏着,进而导致癌细胞脱离原发灶,促进了癌细胞浸润性生长和癌转移的发生。但癌细胞由原发灶脱落本身并不足以致命,癌细胞在其他部位的再聚集并出现多发性转移灶才是主要的致死原因。Bukholm等[8]已经注意到乳腺癌患者转移灶内癌组织ECAD与连接素复合体再表达的情况。Jawhari等[9]曾提及无论原发灶癌细胞的α连接素表达正常与否,转移淋巴结内经常可以见到其在癌细胞的不正常表达情况。

　　本研究的结果显示：免疫组织化学染色证实α连接素在转移淋巴结内癌细胞的再表达阳性率为50%，这一较高的再表达阳性率说明,其在转移灶内的再表达阳性与癌细胞在转移部位的再聚集和生长有关。原发灶中肿瘤分化程度越低,恶性程度越高,α连接素的表达水平越低。在转移淋巴结中分化程度越高越易出现α连接素再表达阳性。从蛋白表达水平分析原发灶中的α连接素高于转移淋巴结内的表达水平，在转移淋巴结中α连接素的表达水平又与肿瘤分化程度相关，α连接素在高分化腺癌的表达水平高于中低分化腺癌。这一结果与人类其他转移性肿瘤中α连接素的表达相似，再一次证明了其表达下调或缺失是可以造成肿瘤细胞黏附作用减弱，肿瘤侵入临近组织，肿瘤细胞进入血管和淋巴道，发生浸润转移的。为何α连接素在转移淋巴结中出现较高的再表达阳性率，而在蛋白表达水平上原发灶仍然呈现出较高的表达水平。我们认为可能是由于某种原因使得α连接素与ECAD复合体分离开来,游离于细胞质中，所以在免疫组化染色中表达降低或缺失的α连接素，在蛋白分析中仍然可以检测到有α连接素的表达，而在转移淋巴结中分化较好的肿瘤细胞更易表达出α连接素。

　　研究结果还表明免疫组化染色中再表达阳性的转移淋巴结中的α连接素蛋白表达与再表达阴性的转移淋巴结中α连接素蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)，15例再表达阳性的转移淋巴结中,高分化腺癌占到了66.7%(10/15),远高于中低分化腺癌。我们认为由于转移淋巴结的特定的微环境不同与原发灶所以重新表达出α连接素，而分化程度越好的越容易出现α连接素的再表达，这可能说明了肿瘤细胞在发生以后其分化程度可能发生由低到高的变化，而α连接素的表达水平恰恰揭示了这种变化。

　　综上所述，α连接素功能异常是肿瘤发生发展过程中的重要环节,与其它因素共同作用促进了肿瘤的发生、发展。就如同α连接素在原发灶的不正常表达与癌细胞自原发灶脱落有关一样,其在转移灶内的再表达阳性与癌细胞在转移部位的再聚集和生长有关。α连接素在转移灶内的再表达与肿瘤分化程度相关，我们认为，分化程度较低的原发肿瘤由于α连接素表达的降低或缺失使得肿瘤细胞更容易从原发灶脱落，而在转移灶内分化程度较好的肿瘤，其分化程度接近正常组织，α连接素的表达更容易出现，从而更容易形成转移灶。因此认为检测α连接素蛋白表达水平可能成为判断胃癌患者预后的又一指标。

　　【参考文献】

　　1 张书凯，王玉珍，陈新.RhoA抑制剂C3转移酶对大鼠肝星状细胞黏附和迁移的影响.河北医药，2007，29：784785.

　　2 徐采朴, 周永宁, 陈渝.α连接素表达与胃癌生物学行为的关系. 世界华人消化杂志，2003，11:12751278.

　　3 Andrews NA, Jones AS, Helliwell TR, et al. Expressionof the Ecadherincatenin cell adherin complex in primarysquamous cell carcinoma of the head and neck and their nodal metastases. Br J Cancer，1997，75:14741480.

　　4 戴冬秋，陈峻青，徐慧绵，等.E钙粘素及α连接素的表达与胃癌生物学行为及淋巴结转移规律的关系.中华肿瘤杂志，2001，23：35.

　　5 Yoshino I, Kase S, Yano T, et al. Exp ression status of E  cadherin and alpha,beta,and gammacatenins in thymoma.The Annals of Thoracic Surgery,2002,73:933937.

　　6 Ebert MP, Yu J,Hoffmann J，et al. Loss of betacatenin expression in metastaticgastric cancer.Journal of clinical oncology,2003,21:17081714.

　　7 邹文，胡春宏，周建平，等.E钙粘素和α、β、γ连环的表达与乳腺癌的转移和预后关系.湖南医科大学学报，2002,27:499502.

　　8 Bukholm IK, Nesland JM, BorresenDale AL. Reexpressionof Ecadherin, αcatenin and βcatenin, but not of γcatenin,in metastatic tissue from breast cancer patients. J Pathol，2000，190:1519.

　　9 Jawhari A, Jordan S, Poole S,et al. Abnormal immunoreacticity of the Ecadherincatenin complex in gastric carcinoma: relationship with patient survival.Gastroenterology，1997，112:4654.