炎症对CWBL/6J小鼠肝脏胆固醇积聚及纤维化的影响

目前,非酒精性脂肪性肝病 (NAFLD)的发病率在全国范围内呈快速上升趋势,我国发达地区成人NAFLD患 病率已超过 15%,接近西方国家20%~30%的 水平;成为仅次于病毒性肝炎的第二大肝病,被公认为隐蔽性肝硬化的常见原因。甘油三酯和脂肪酸在 NAFLD发 生和发展中的作用一直被广泛重视,而胆固醇在NAFLD中扮演的角色却往往被忽视。最近研究结果表明,胆固醇在肝脏的沉积比甘油三酯引起的损害更严重,它可以启动细胞的内质网应激、氧化应激和凋亡,促进NAFLD从单纯性脂肪肝向脂肪性肝炎、甚至肝坏死发展 :制。因此,肝脏内胆固醇异常积聚的机制值得深人研究。大量证据表明 :炎症应激参与了NAFLD发生和发展的全过程,本课题组通过体外实验证实,炎症可以通过增加胆固醇调节元件结合蛋白 (sterol regulatory element  binding ,protein,SREBP)2及其下游靶基因--控制胆固醇摄入、合成相关基因,如低密度脂蛋白受体及3-羟 -3-甲 基 戊二酰辅酶 A还原酶等 基因的表达,从而使细胞胆固醇的摄人和合成稳态失衡,造成细胞内胆固醇异常积聚而加重肝细胞的损害。本研究拟用CSTBL/6J小 鼠炎症模型,进一步在体内探讨炎症对肝脏内胆固醇积聚及纤维化损害的影响。　　材料与方法　　1.制备小鼠模型 :⒓ 只雄性 C57BL/6j小鼠购自重庆医科大学实验动物中心,健康清洁级,体质量18~23g,随 机分为对照组 (n=6) 和炎症组(n=6),均喂以高脂饮食 (15%脂肪、1.25%胆固醇、 0.5%胆酸),炎症组小鼠隔天皮下注射0.5m11O0/0酪 蛋白建立慢性炎症模型,对照组注射等量等渗盐水,14周处死。　　2.标本采集 :小鼠禁食过夜,腹腔注射0.1ml2%戊 巴比要钠进行麻醉后迅速解剖,经左心室取血,装人1.5ml干净EP管中静置,待血液分层后,3000 r/min离 心10min ,将血清-80℃ 保存。取出肝脏用磷酸盐缓冲液 PBS)洗涤,分三部分 :一部分包埋于OCT胶 中制作冰冻切片,油红0染色观察肝细胞脂肪变性程度 ;一部分固定于多聚甲醛溶液中,进行脱水、透明、浸蜡、包埋、制片,天狼猩红和masson三 色染色 ;其余-80℃冻存,用于组织胆固醇含量、相关基因的mRNA测 定。　　3.血清炎症因子和脂质水平检测 :按照试剂盒 (购自重庆百杰生物公司)中说明书方法测定血清白细胞介素 (IL)6、 血清淀粉样蛋白A、总胆固醇 (TC)、 低密度脂蛋白和高密度脂蛋白水平。　　4.肝组织中炎症因子检测:用荧光定量PCR法检测肝组织中单核细胞趋化蛋白1和 肿瘤坏死 因子 (TNF)α 的mRNA表 达水平。　　5.肝组织胆固醇含量检测 :肝组织研磨后加PBS溶 解,9000r/min离心10min ,沉淀物中加人1min氯仿、甲醇混合物 (2∶ 1),超声破碎1min ;放人孵箱震荡15min , 9000r/min离心10min,沉淀加入 NaoH,孵 育 12h,用Lowry法 测定总蛋白质量 ;上清液真空干燥后,用酶法测定TC和游离胆固醇的 含量。胆固醇酯=TC-FC,得 出的结果除以总蛋白质量即为 CE的含量。　　6,油红O染色 :肝组织冰冻切片,厚约6~10um,空 气中干燥 5min ,用 10%甲醛溶液固定30min。1,2-丙二醇孵育2min ,ORO工 作液染色 15min ,自 来水冲洗 51min,干燥后用 GⅤA水溶性封片剂包埋。显微镜下观察并照相。　　7.天狼猩红染色 :石蜡切片常规脱蜡至水,苏木素染核 ,自 来水冲洗 5min;浸 入 0.1%天狼猩红 -苦味酸饱和液 1h,酸化水洗涤 2次,甩干,无水乙醇脱水 2次 ;中性树胶封片。染色结果胶原纤维呈红色,胞核呈黑色,佘呈黄色。　　8,masson三色染色 :石蜡切片处理、染核同7,95%乙醇溶液冲洗 2次 ;苦味酸乙醇分色 5min,蒸馏水冲洗 ;丽春红酸性品红液染色5min,蒸馏水冲洗 ;1%磷钼酸水溶液处理约 5min,醋酸苯胺蓝液复染 5min,1%冰醋酸处理 1min,95%乙醇溶液、无水乙醇脱水各5min ;二甲苯透明5min 中性树胶封片。染色结果胶原纤维呈蓝色,胞质、肌纤维和红细胞呈红色,胞核呈蓝褐色。　　9.实时定量 PCR:用试剂盒 (购 自美国普洛麦格公司)提取肝组织总 RNA。 用微量分光光度计(购 自美国伯乐公司 )检测RNA样品纯度.用逆转录试剂盒 (购自美国应用生物系统公司 )将 RNA逆转录得cDNA,逆 转录条件 :25℃ 10min,37℃ 2h,85℃ 5s,产 物-30℃保存。以cDNA为 模板,以 β -肌动蛋白为内参照,进行 RT-PCR(用购自美国伯乐公司的iQ5RT-PCR仪),PCR引物序列。 PCR条件 :50℃2 min, 95℃ 5 min ; 95℃ 20s, 55 ℃  20s, 72℃3Os,共旬个循环。RT PCR结 果采用 Ct值比较相对定量法(Δ ΔCt)表 示,β -肌动蛋白作为参照管。用△△ Ct计 算基因的表达水平,公式 :炎症组相对于对照组基因表达水平的倍数=- exp(△ △ Ct),其中△△ Ct=炎 症组△ Ct一对照组△ Ct,△Ct=具体测定基因的Ct值一β -肌动蛋白基因Ct值 。　　10.统计学方法:用 SPSS19.0统计软件处理数据,数据以均数 ±标准差表 示,对符合正态分布和方差齐的资料　　结   果　　1.小鼠血清及肝组织中炎症因子的水平 :与对照组相比,炎症组小鼠血清中IL-6和 SAA水平增高;肝组织中MCP1和 TNFα 的mRNA表 达水平也增高,差异均有统计学意义。 表明炎症组小鼠机体处于慢性炎症状态,小鼠炎症模型制造成功。　　2.小鼠血清及肝组织的脂质水平 :与对照组小鼠相比,炎症组小鼠血清中TC、 HDL、 LDL水平均明显下降 ;同时,炎症组小鼠肝组织中TC、 FC、E水平均明显增高。　　3.小鼠肝组织油红0染色 :对照组列 、 鼠肝细胞中有少量红染颗粒,脂质沉积不明显,结构正常,肝细胞排列整齐 ;而炎症组小鼠肝细胞呈现脂肪变性,肝细胞体积增大、排列紊乱,肝脂中有大量的红染颗粒,胞核被推向周边,脂质沉积异常增加。　　4.天狼猩红和masson三色染色 :与对照组小鼠相比,天狼猩红染色后炎症组可见明显增多、变粗的红色网状纤维,在肝组织中央静脉周围、汇管区及肝窦周围最为明显。masson三 色染色后炎症组同样可见明显增多、变粗的蓝色网状纤维。。　　5.实时定量PCR检测结果:与对照组小鼠相比,炎症组小 鼠肝细胞 SREBP-2、 LDLr、 HMGCoA-R活化 转 录 因 子6。 葡萄糖调节蛋 白78表 达水平增高,差异有统计学意义。LN、TGFβ 、I与 Ⅳ型胶原mRNA表 达水平明显降低 （t=3.765,P<0.01),差异有统计学意义。　　讨 论　　用基因敲除法阻断肝脏或脂肪组织中炎症反应的通路,可以显著降低脂肪在肝脏聚集的发生,说明全身和肝脏局部的炎症反应在NAFLD形成中起重要作用。而炎症反应是如何影响肝脏脂质代谢,从而导致脂肪在肝脏聚集、肝损害加重及肝纤维化发生的分子机制并不清楚。SREBP作 为一种膜结合的核转录因子,在胆固醇代谢中起中心作用,它包括三个成员 : SREBP- 1c和SREBP -2,其中SREBP -2主要调控胆固醇代谢,可 以分别与LDLr和HMGCoA-r基 因启动子的胆固醇调节元仵发生特异性结合,从而增强 LDLr和HMGCoA- r的 转录。通 常 ,LDL通 过LDIF途径摄人细胞,而HMGCoA- r是 胆固醇内源眭合成途径中的重要限速酶,二者在维持细胞胆固醇的吸收与内源跬合成中扮演了重要角色。　　本动物实验结果显示,炎症组小鼠血清中TC、HDL、 LDL水平与对照组相比均明显下降,而小鼠肝组织中TC、 FC、 CE水平明显增高,说明炎症组小鼠胆固醇在肝脏的积聚较对照组更为明显 ;进一步通过基因检测,发现炎症组小鼠肝组织SREBP-2、LDLr、HMGCoA- r基 因表达明显增高,说明炎症可以通过影响胆固醇的摄入和合成导致肝脏胆固醇异常积聚。同时,由于炎症促进小鼠的胆固醇从血液向肝脏异常积聚而致血液中胆固醇水平相对减低,这一结果也与Ma等观察炎症对 ApoE KO小 鼠胆固醇代谢的影响结果一致。油红O染色显示炎症组小鼠肝细胞中有大量的红染脂质颗粒,肝脏的脂质沉积异常增加,并且肝脏结构有明显改变,同样提示炎症与肝脏胆固醇沉积及损害有密切联系。　　内质网应激在肝纤维化所致肝损伤中的作用已得到更为深人的探讨,但其与胆固醇积聚和肝纤维化的发生是否存在必然联系,其机制仍需进一步探讨。GRP78 是内质网分子伴侣蛋白,介导新生蛋白的加工成熟,是促进正常生长状态下细胞蛋白质成熟、维持细胞机能和生命的关键性调节蛋白,被认为是ERS标 志蛋白 ;在应激状态下内质网内新生蛋白发生错误折叠,激活细胞内的未折叠蛋白反应,通过 ATF-6作用于GRP78 启动子,上调 GRP优 基因的转录活性,使其表达量增高。本动物实验观察到炎症组小鼠肝细胞 ATF-6、GRP78mRNA表达水平均明显增高,说明炎症导致的肝脏胆固醇积聚与内质网应激有明显的相关性。　　肝纤维化时,胶原蛋白可明显增加,促纤维化相关基因TGF β、LN、 I/IⅤ 型胶原的合成增多是肝纤维化的早期表现之一,而抗纤维化相关基因BMP-7的 合成减少也能证明肝纤维化的发生。本动物实验通过天狼猩红和masson三 色染色显示,炎症组小鼠较对照组小鼠的纤维化明显增多,同 时实时定量 PCR也显示炎症组小鼠肝细胞 TGF β、LN、 I/IⅤ 型胶原mRNA表 达水平均明显增高,而BMP-7的mRNA表 达水平明显降低,说明炎症可以通过增加促纤维化因子和抑制抗纤维化因子表达,从而促进肝纤维化发生和发展。　　本实验通过建立 C57BL/6J小 鼠炎症模型,证实了炎症可以上调核转录因子SREBR-2的 表达,导致其下游靶基因LDLr、 HMGCOA-r表 达异常增加 ,引起肝脏出现异常大量的胆固醇沉积。在炎症和异常胆固醇积聚的作用下,内质网应激相关基因的表达显著增加,促纤维化相关基因的表达显著增加,而抗纤维化相关基因表达显著减少,促使肝纤维化的发生及发展。该研究为阐明炎症作为独立的危险因子在脂肪性肝疾病发生过程中的作用提供了实验依据,也为今后深入探讨炎症、胆固醇代谢与肝脏损害及纤维化发生的分子机制打下了基础。

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