Wnt3a对肝星状细胞增殖活化以及转化生长因子β/Smad表达的影响

肝纤维化是指由各种致病因子所致肝内细胞外基质（extracellular matrix,ECM)过度沉积的一个病理过程。如果控制不及时,可最终发展为肝硬化并引起严重的并发症(门静脉高压、肝癌、肝衰竭等)。 肝纤维化的核心机制是肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSC)的 活化,而转化生长因子 β 1(transforming growth factor-beta1,TGF β1)通过其下游的srnad等促进HSC活化、增殖,从而在肝纤维化的进程中发挥了关键作用。 最近的研究结果显示,Wnt信 号通路在调控细胞的迁移、黏附、生长、分化、上皮间质转化等过程中发挥着重要作用。它不仅与肺脏和肾脏纤维化的形成有关系,也与肝纤维化、肝癌的形成有关。其中Wnt3是wnt家族中的重要成员,它能激活经典的Wnt/β -catenin 信号,在组织的自我更新中发挥重要作用。但Wnt3a在 肝纤维化发生和发展过程中的作用鲜有报道,本研究就Wnt3a在 肝纤维化的形成过程中对HsC的 影响进行初步的探索。　　材料与方法　　1. 实验材料 :大鼠HSC -T6细胞株由华中科技大学同济医学院附属协和医院消化内科实验室惠赠 ;胎牛血清和DMEM高糖培养基购 自美国Hyclone公 司 ;磷酸盐缓冲溶液 (PBS)粉和胰酶a1,TGF 粉购自武汉博士德公司 ;Cell-Light TM  EdU光显微镜检测试剂盒购自广州瑞博生物科技有限公司 ;Smad3单 克隆抗体购自英国abcam公 司 ;α平滑肌肌动蛋白 (α- SMA)单克隆抗体购自美国Bioworld Technology公 司 ;srnad7和 TGFβ 1单克隆抗体购自武汉博士德公司 ;重组Wnt3a购 自美国peprotech公 司 ;蛋白提取试剂盒、BCA法蛋白定量试剂盒购自武汉谷歌生物科技有限公司 ;37℃恒温培养箱购自美国Forma Scientific公司 ;倒置相差显微镜、荧光显微镜购自日本Olympus公 司 ;十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)仪购自美国BioRad公 司。2.HSC-T6细 胞的培养 :用含 10%胎牛血清、100%U/mL青 霉素、I00ug/ml 链霉素的DMEM高糖培养基培养于37℃、 5%二氧化碳条件下,1~2d换 一次液,2~3d用25%的胰酶以1∶ 2消化传代。　　3.细胞增殖的测定 :用 EDU法来测定HSC -T6经Wnt3a刺 激后 的增殖情况。以每 孔 8000个HSC -T6的浓度接种于96孔板,培养24h后 换无血清DMEM培养液同步化培养24h,然 后用不同浓度 的 Wnt3a （0、50、 100、 150、 200、250、 300 ng/ml )刺 激HSC -T6 24h后 ,加入50u mol/L EDU培养基 100ul孵育 2h,4%多 聚甲醛固定 15min ,0.5%Triton X-100透化 10min, 加人 Apollo 染色反应液避光孵育 30min。Hoechst避 光孵育 10min ,0.5% Triton X-100透 化3次,每次 10min 。最后用荧光显微镜在600nm和 450nm处摄取图片 ,并加以分析。　　4.Westem blot分 析 :将 HSC-T6以 10的5次方个 /ml的 浓度接种于6孔培养板中,培养至90%融合时,换无血清DMEM培养基同步化培养 24h后 加人不同浓度的Wnt3a(100、200、 300ng/ml ),分别培养 24h、 48h后 终止。按照蛋白提取及BCA法蛋白定量试剂盒说明分别提取总蛋白并进行定量。然后加人上样缓冲液,于 100℃ 煮沸 10min使蛋白变性。每孔上样40 ug总 蛋白,进行SDS- PAGE。电泳结束后将蛋白转移到硝酸纤维素膜上,转膜条件为 :电压 200mA,时 间为 100MIN(TGF β1、α-SMA和smad7)或 120min (Smad3)。 聚偏氟乙烯膜于室温下脱色摇床封闭2h后,加人用TBST稀释至合适浓度的第一抗体,其稀释浓度为:α-SMA 1∶ 200稀释、 TGF β1 1∶200稀释、Smad3 1∶ 600稀释和Smad71∶200稀释。室温孵育 2h后 再分别加入与第一抗体匹配的第二抗体 (用 TBST以1∶40000稀释),室温孵育2h后 进行定影显影,并以⒊磷酸甘油醛脱氢酶 (GAPDH)为 内参照,BandScan分 析胶片灰度值。　　5.统计学方法:数据用中位数 ±标准差 (M±s)表 示,用 SPSS17.0统 计软件,多组数据间的比较用单因素方差分析,P<0.05为 差异有统计学意义,并使用双变量相关分析研究数据之间的相关性。　　结   果　　1.Wnt3a对 HSC -T6增殖的影响 :用不同浓度的Wnt3a(0,50,100,150,200,300ng/ml) 激HSC 24h后 ,用 EDU法测定HSC -T6的增殖率。结果显示,Wnt3a能 促进HSC -T6细 胞的增殖,当浓度为200ng/m时 ,增殖率达到最大 (63.00%±2.30%),显著高于未处理组(35.12%± 3.72%)、 50 ng/ml (38.10%±2.23%)、 100ng/ml(40.98%±2.62%)及150 ng/ml组 (51.30%±2.54%),P值分别为0.002、0.004、 0.002、0.025,P值均<0.05,而250ng/ml及 300 ng/ml组的55.21%±1.42%和 52.03± 1.60%相差不明显(P值分别为0.089、0.071，P值均>0.05)。2.Wnt3a对 HSC-T6细胞活化的影响 :采用Western blot法 测定不同浓度的Wnt3a(0,50,100,150,200,300ng/ml)分别刺激HSC-T6 24、48h后α -SMA的蛋白水平,随着Wnt3a浓度的增加和刺激时间的延长, α -SMA的 蛋白表达也相应增加,刺激 48h后 和 GAPDH的灰度比值 分 别 为 0.3925± 0.0086、 0.7122 ±0.0904、1.0140±0.6784和1.0860 ±0.0101。在 300 ng/ml Wnt3a刺激48h时 达到峰值,显著高于其他浓度组P值分别为0.001、0.003、0.010,P 值均<0.05)。　　3.Wnt3a对 HSC中TGF β /Smad表 达的影响:用Western blot法 测定不同浓度的Wnt3a(100ng/ml 、200ng/ml、300ng/ml )分别刺激 HSC24 、48h后TGF β 1、 Smad3和Smad7蛋白的表达。结果显示,随着Wnt3a浓 度的增加和刺激时间的延长,TGF β 1、 Smad3的 蛋白表达也相应增加,并在300ng/ml Wnt3a刺激48h时达到峰值,它们和GAPDH的灰度比值分别为 :1.0346±0.0118、1.0306±0.0122( P值均<0.05);而Smad7的 蛋白表达随着Wnt3a浓 度的增加和刺激时间的延长而减少,在 300ng/ml Wnt3a刺激48h时 达到最小,它和GAPDH的灰度比值为0.7736±0.0139 P<0.05);并且α -SMA的表达与TGF β 1和smad3分 别有 明显的正相关关系 (r=0.968, P<0.05;r=0.997,P<0.01),而和Smad7的 表达有明显的负相关关系(r=0.960, P<0.05)。　　讨   论　　肝纤维化形成机制复杂,治疗难度较大,因而研究其发病机制,寻找新的治疗靶点成为研究热点。其中通过抑制TGFβ /Smad这 一通路来抗纤维化已有较多研究。但是也有报道指出,抑制TGFβ /Smad耐 信号会促进癌症的发生,这可能与它在免疫抑制方面的关键作用有关。TGF β活化的抑制还可能导致过度的免疫激活和炎症的发生。这说明,单纯的通过抑制TGF β来抗纤维化既缺乏特异性,还可能给机体带来负面影响。近来的研究结果显示,肝脏卵圆细胞 (HOC)是 HSC的 前体细胞。 其向HSC的转化则可能是促进肝纤维化发生、发展的重要机制,而在此过程中,Wnt信 号途径发挥了关键作用。因此,研究 Wnt通 路在肝纤维化中的作用及其机制具有重要意义。　　Wnt通路是新近发现的一条信号通路,它与细胞的增殖、分化以及凋亡等密切相关。其中Wnt3a是 Wnt基 因家族中的一个重要的成员,其基因早在 1992年被发现。Wnt3a能 激活经典的 Wntβ -catenin通路,促进β -catenin的积聚,而我们前期的研究结果显示β -catenin能增强TGF β1的生物学效应,阻断Wntβ -catenin信号通路能实现活化的HsC凋 亡率增加。这些结果提示 Wnt3与肝纤维化有着密切联系。　　本实验所采用的 HSC-T6细 胞株,是转染了SV40病 毒大 T抗原的SD大鼠HSC,属于一种永生化的HSC,细胞传代后能比较稳定地培养,其表型为活化的HSC 。它与人 HSC具有相似的形态学、标志物及培养生长特点。因此, HSC-T6可作为进行 HSC基因表达调控、抗纤维化药物作用及肝纤维化发生机制等研究的理想细胞膜型。本文结果显示, Wnt3a能 明显促进 HSC细胞的增殖,并在 200ng/ml  Wnt3a刺 激 24h时 增殖率达到最大,当浓度再增大至300ng/ml时其增殖率不再增加,而处于平台期。本研究结果还显示,Wnt3a能促进 α-SMA的 蛋白表达,且α-SMA与Smad3、TGF β1的 蛋白表达呈正相关,与 Smad7呈 负相关。α-SMA是 HSC活化 的标 志。这 就 表明Wnt3a能 促进 HSC的 活化,而且 HSC的活化是通过TGFβ /Smad的 上调来实现的。　　越来越多的研究者认为,TGF β /srnad是 目前已知的与器官纤维化形成关系最为密切的信号通路。和正常肝脏组织相比,纤维化肝组织中Smad2、Smad3mRNA和 蛋 白表 达 水 平 明显 升 高,而smadT表 达水平降低。可见和Sm猁 2和 Smad3不同,smad7是 TGF β信号转导途径的主要抑制性蛋白,具有抗纤维化的作用。本研究结果显示,当300ng/ml Wnt3a束 刂 激 HSC48h时 ,TGF β1、Smad3的 蛋白表达达到最大,而 Smad7的 蛋白表达随着 Wnt3a浓 度的增加和刺激时间的延长而减少,在300ng/ml Wnt3a刺激 48h时达到最小。这些结果均提示 Wnt3a能 促进 HSC表达促纤维化的蛋白,而下调纤维化抑制性蛋白的表达。肝纤维化的发生是由多种机制参与的过程,对其机制的研究有助于寻求新的治疗靶点来阻止纤维化的进展。本研究结果表明,Wrlt信 号转导通路在肝纤维化发生和发展中起重要作用,Wnt3a促 进HSC的增殖活化,上调TGF β1、 Smad3的 蛋白表达,而下调 Smad7的 蛋白表达,证实其具有促进纤维化形成的作用。调控 Wnt信 号通路是否可抑制 HSC增殖、活化及具有抗肝纤维化作用是我们进一步的研究方向,并可能为肝纤维化的防治提供新的作用靶点。但是,除了本研究结果之外, Wnt信 号转导通路是否还与其他因子发生相互作用来影响肝纤维化的发生还有待进一步研究。

 参考文献　　1.Breitkopf K,Haas S,Wiercinska E. Anti-TGF-beta strategies for the treatment of chronic liver disease[J].Alcoholism:Clinical and Experimental Research,2005,(11 Suppl):121S-131S.　　2.Logan CY,Nusse R. The Wnt signaling pathway in development and disease[J].Annual Review of Cell and Developmental Biology,2004.781-810.　　3.Lai SL,Chien A J,Moon RT. Wnt/Fz signaling and the cytoskeleton:potential roles in tumorigenesis[J].Cell Research,2009.532-545.　　4.Chilosi M,Poletti V,Zamò A. Aberrant Wnt/beta-catenin pathway activation in idiopathic pulmonary fibrosis[J].American Journal of Pathology,2003.1495-1502.　　5.Surendran K,McCaul SP,Simon TC. A role for Wnt-4 in renal fibrosis[J].American Journal of Physiology-Renal Physiology,2002.F431-F341.　　6.Loeppen S,Koehle C,Buchmann A. A beta-catenin-dependent pathway regulates expression of cytochrome P450 isoforms in mouse liver tumors[J].Carcinogenesis,2005,(1):239-248.doi:10.1093/carcin/bgh298.　　7.Zhang Y,Li XM,Zhang FK. Activation of canonical Wnt signaling pathway promotes proliferation and self-renewal of rat hepatic oval cell line WB-F344 in vitro[J].World Journal of Gastroenterology,2008.6673-6680.　　8.Tsukada S,Parsons C J,Rippe RA. Mechanisms of liver fibrosis[J].Clinica Chimica Acta,2006,(1/2):33-60.doi:10.1016/j.cca.2005.06.014.　　9.Wynn TA. Cellular and molecular mechanisms of fibrosis[J].Journal of Pathology,2008.199-210.　　10.Gressner OA,Rizk MS,Kovalenko E. Changing the pathogenetic roadmap of liver fibrosis?. Where did it start,where will it go[J].Journal of Gastroenterology and Hepatology,2008,(7 Pt 1):1024-1035.doi:10.1111/j.1440-1746.2008.05345.x.　　11.Friedman SL. Hepatic stellate cells:protean,multifunctional,and enigmatic cells of the liver[J].Physiological Reviews,2008.125-172.　　12.Bataller R,Brenner DA. Liver fibrosis[J].Journal of Clinical Investigation,2005.209-218.　　13.Le Bousse-Kerdilès MC,Martyré MC,Samson M. Cellular and molecular mechanisms underlying bone marrow and liver fibrosis:a review[J].European Cytokine Network,2008.69-80.　　14.Inagaki Y,Okazaki I. Emerging insights into Transforming growth factor beta Smad signal in hepatic fibrogenesis[J].Gut,2007,(2):284-292.doi:10.1136/gut.2005.088690.　　15.Yang L,Jung Y,Omenetti A. Fate-mapping evidence that hepatic stellate cells are epithelial progenitors in adult mouse livers[J].Stem Cells,2008,(8):2104-2113.doi:10.1634/stemcells.2008-0115.　　16.Apte U,Thompson MD,Cui S. Wnt/beta-catenin signaling mediates oval cell response in rodents[J].Hepatology,2008.288-295.　　17.Gordon MD,Nusse R. Wnt signaling:multiple pathways,multiple receptors,and multiple transcription factors[J].Journal of Biological Chemistry,2006.22429-22433.　　18.李文庭,贺永文,肖志宏. β-catenin对TGFβ1活化HSC的影响[J].中华肝脏病杂志,2009.188-192.　　19.翁志宏,雷延昌,彭程. 阻断Wnt/β-Catenin信号通路对活化肝星状细胞凋亡的影响[J].中华肝脏病杂志,2007,(6):471-472.doi:10.3760/j.issn:1007-3418.2007.06.022.　　20.Friedman SL,Lalazar A,Crong L. HSC-T6 cells,an immortalized rat hepatic stellate cell line[J].Hepatology,1997,(4Pt):338A.　　21.Vogel S,Piantedosi R,Frank J. An immortalized rat liver stellate cell line(HSC-T6):a new cell model for the study of retinoid metabolism in vitro[J].Journal of Lipid Research,2000.882-893.　　22.Geerts A. History,heterogeneity,developmental biology,and functions of quiescent hepatic stellate cells[J].Seminars in Liver Disease,2001.311-335.　　23.Kitamura Y,Ninomiya H. Smad expression of hepatic stellate cells in liver cirrhosis in vivo and hepatic stellate cell line in vitro[J].Pathology International,2003.18-26.　　24.Liang TJ,Yuan JH,Tan YR. Effect of ursodeoxycholic acid on TGF betal/Smad signaling pathway in rat hepatic stellate cells[J].Chinese Medical Journal(Engl),2009.1209-1213.　　25.Heldin CH,Miyazono K,ten Dijke P. TGF-beta signalling from cell membrane to nucleus through SMAD proteins[J].Nature,1997.465-471.　　26.Ihn H. Pathogenesis of fibrosis:role of TGF-beta and CTGF[J].Current Opinion in Rheumatology,2002,(6):681-685.doi:10.1097/00002281-200211000-00009.