125I粒子抑制乳腺癌细胞bFGF表达的实验研究

　　作者：张万福　王明春　罗开元　李波　杨嵘　章治平　李晓刚　褚焱 作者单位：昆明医学院第四附属医院　普外科　(云南　昆明　650021)

　　【摘要】 目的：探讨125I粒子对乳腺癌细胞中碱性成纤维细胞因子(bFGF)表达的影响及其在抑制肿瘤细胞增殖方面的作用机制。方法：建立人乳腺癌细胞株MCF-7裸鼠皮下移植瘤模型，根据处死时间，随机分为8组，包括D7、D14、D21、D28组(对照组)及S7、S14、S21、S28组(实验组)，每组6只，对照组植入空白粒子(0 mCi)，实验组植入125I粒子(0.4 mCi)。观察粒子植入后瘤体生长情况，粒子植入后第7、14、21、28天分别处死各组荷瘤小鼠。半定量RT-PCR、免疫组织化学染色方法检测bFGF mRNA及其蛋白的表达。结果：植入125I粒子后，实验组肿瘤生长缓慢，肿瘤抑制率为53.27%。粒子植入第28天，与对照组相比，实验组肿瘤组织的bFGF mRNA及蛋白表达明显降低，差异有统计学意义(χ2=45.788，P<0.01)。结论：125I粒子抑制bFGF mRNA和蛋白的表达是其治疗乳腺癌增殖的分子生物学机制之一。

　　【关键词】 碘·乳腺肿瘤·成纤维细胞生长因子2·小鼠，裸

　　【ABSTRACT】 Objective: To investigate the mechanism of 125I refraining the growth of tumors cell by hindering the expression of basic firoblast growth factor(bFGF) in breast cancer. Methods: The animal models of the breast cancer cell(MCF-7) were established by subcutaneously injecting the tumor cells into nude mice. The mice were divided into eight groups randomly and there 　　乳腺癌严重威胁女性的身心健康，近年来随着诊断技术水平不断提高，越来越多早期乳腺癌被发现，保留乳房手术也逐渐增多，乳腺癌局部切除结合125I粒子组织间植入放疗是保乳手术重要的方法之一。但目前125I粒子影响乳腺癌发生和转归的分子生物学机制尚不十分清楚，本实验通过构建裸小鼠乳腺癌细胞模型，植入125I粒子，测量肿瘤组织内碱性成纤维细胞因子(basic firoblast growth factor，bFGF)的变化，揭示125I治疗乳腺癌的生物学机制。

　　1　材料与方法

　　1.1　材料

　　实验动物及瘤细胞株，BALB/c-nu/nu裸小鼠雌性48只，乳腺癌细胞株MCF-7，均由中国医学科学院肿瘤研究所提供。空载粒子(0 mCi)和125I粒子(0.4 mCi)，由上海欣科医药公司提供，美国食品药品监督管理局注册号为9614503，ISO9001认证编号为40-3842-339113。兔抗人单克隆bFGF抗体、SABC试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。DAB显色试剂盒购自福州迈新生物技术开发公司。总RNA提取试剂盒购自北京鼎国生物试剂有限公司。逆转录酶购自东洋纺上海生物科技有限公司。Taq酶购自美国Invitrogen公司产品。六碱基随机引物购自美国Promega公司。dNTP购自东洋纺上海生物科技有限公司。引物设计、合成由武汉博士德生物工程有限公司完成。bFGF上游引物：5’-TTTACTATGTTTTGACTTCCTG-3’，长度：22 Mer，Tm值：55 ℃，相对分子质量：6.647×103。下游引物： 5’-CTTCTGTTTATGACTGCTTCTG-3’，长度：22 Mer， Tm值：59 ℃，相对分子质量：6.648×103。扩增片断长度为298 bp。参照基因GAPDH(甘油醛3-磷酸脱氢酶)，上游引物：5’- TTGGTATCGTGGAAGGACTCATG-3’，长度：22 Mer，Tm值：67 ℃，相对分子质量：6.593×103。下游引物: 5’-GTTGCTGTAGCCAAATTCGTTGT-3’，长度：22 Mer，Tm值：67 ℃，相对分子质量：6.593×103。扩增片断长度为475 bp。粒子植入及防护设备由云南省125I粒子植入中心实验室提供。

　　1.2　荷瘤裸小鼠模型建立、分组、粒子植入

　　由中国医学科学院肿瘤研究所制作人类乳腺癌细胞MCF-7裸鼠皮下移植瘤模型。根据处死时间，荷瘤小鼠随机分为8组，即对照组4组：D7、D14、D21、D28组;实验组4组：S7、S14、S21、S28组。每组6只，共48只。对照组植入空白粒子，实验组植入125I粒子(0.4 mCi)。粒子植入前做好防护。125I粒子放入戊二醛中浸泡30 min消毒，植入部位用75%乙醇消毒，18号植入针在距肿瘤边缘5 mm处刺破皮肤，皮下潜行至肿瘤中心部位植入粒子。

　　1.3　肿瘤生长曲线的绘制

　　每3 d测量肿瘤最长径值(a)和最短径值(b)，根据公式V=ab2/2换算出肿瘤体积[1]，绘制荷瘤裸小鼠肿瘤生长曲线。

　　1.4　肿瘤抑制率的计算　植入粒子后于第7、14、21、28天4个时相点处死2组荷瘤裸小鼠。处死后立即取出肿瘤组织，分析天平上称质量。按照以下公式计算出肿瘤抑制率。肿瘤抑制率=(对照组平均瘤质量-实验组平均瘤质量)/对照组平均瘤质量×100%[1]。

　　1.5　bFGF mRNA及其蛋白的检测

　　用半定量RT-PCR、免疫组织化学染色方法检测bFGF mRNA及其蛋白的表达。

　　1.6　免疫组织化学染色判断标准

　　参照Takahashi判断标准[2-3]。1)染色强度计分：0分为完全阴性;1分为弱阳性，仅少量细胞着色，染色呈淡黄色;2分为阳性，染色呈黄色;3分为强阳性，多量细胞着色，染色呈褐色或棕褐色。2)阳性细胞计分：每张切片随机选取3个高倍视野(×400)记200个细胞，计算阳性细胞占细胞总数的百分比，阳性细胞<10%为 0分;10%～25%为1分;26%～50%为2分;>50%为3分。二者相加0～2分为阴性，≥3分为阳性。

　　1.7　统计学处理

　　应用SPSS11.5统计软件包进行分析，体积和瘤质量比较用方差分析;免疫组织化学染色结果用χ2检验，RT-PCR结果用随机区组方差分析。检验水准α=0.05。

　　2　结果

　　2.1　肿瘤生长曲线

　　粒子植入后对照组荷瘤裸小鼠肿瘤生长迅速，实验组肿瘤生长明显减慢，后期出现负生长。2组肿瘤生长曲线见图1。

　　2.2　肿瘤抑制率

　　对照组平均瘤质量为(2.388±0.301)g，实验组平均瘤质量为(1.116±0.055)g，肿瘤抑制率为53.27%。

　　2.3　免疫组织化学检测

　　D7与S7组，D14与S14组比较，阳性率差异无统计学意义(P>0.05);而S21与D21组，S28与D28组比较明显降低(P<0.05)。对照组各组间差异无统计学意义(P>0.05)，而实验组内S21组明显低于S14组，同时高于S28组(P<0.05)。说明125I粒子对bFGF表达的影响于粒子植入后第3周比较显著(表1)。

　　2.4　RT-PCR检测

　　从图2、3可以看出，实验组bFGF mRNA的表达逐渐降低，而对照组呈一近似直线。与对照组比较，实验组第21天(S21组)开始出现差别，第28天(S28组)差别更明显(P<0.05)。而对照组内各组差异无统计学意义(P>0.05)。实验组内各组bFGF mRNA表达随时间增加逐渐降低，其中S21组低于S14组，高于S28组(P<0.05)，而S7组与S14组差异无统计学意义(P>0.05)。参照基因GAPDH电泳图像，对照组与实验组及各组内部差别不明显(图4)。

　　3　讨论

　　125I粒子已经用于各种实体肿瘤的治疗[4-6]，治疗机制为：粒子释放出X、γ射线破坏肿瘤细胞核的DNA，抑制相关促肿瘤因子、血管因子的表达，从而控制肿瘤生长、转移。组织间植入放射性125I粒子所产生的γ射线能量虽然不大，但能持续对肿瘤起作用，因此能不断杀伤肿瘤细胞，经过足够的剂量和半衰期(59.43 d)，能大部分杀灭肿瘤细胞，使肿瘤细胞失去繁殖能力，从而达到有效地治疗。

　　bFGF是近年研究的热点，分布于体内许多组织，是细胞生长、分化和血管生成重要因子，能促进肿瘤细胞的有丝分裂并参与血管新生。有报道称bFGF与多种实体癌的生长和转移有关[7]。bFGF与乳腺癌关系密切，Smith等[8]采用ELISA方法检测结果表明，bFGF在乳腺癌组织中的浓度是正常乳腺组织的10倍，高于乳腺癌旁组织的3倍，bFGF在乳腺癌组织中高表达，主要由肿瘤细胞合成、分泌。一方面具有血管生成效应，另一方面也直接促进肿瘤细胞生长，从而导致乳腺癌的进展、转移。本研究从蛋白和基因2个层面证实了125I粒子抑制bFGF的表达，免疫组织化学结果显示bFGF主要表达于细胞膜上，阳性颗粒为棕色颗粒，实验组的S21、S28组，bFGF低表达，而同期对照组则高表达，证明125I粒子发挥可以观察到的效应时间约在第21天;125I粒子抑制bFGF mRNA的表达，S21、S28组表达明显低于D21、D28组(P<0.01);而对照组各组比较，则没有明显变化(P>0.05)。实验组各组比较，S7、S14组bFGF mRNA表达差异无统计学意义，S21、S28组与S7、S14组相比差异有统计学意义(P<0.05)。基因层面与蛋白层面结果类似。

　　综上所述，125I粒子抑制乳腺癌组织bFGF的表达是其治疗乳腺癌的分子生物学机制之一，其对bFGF表达在第21天产生可以观察到的效应。笔者推测125I粒子抑制乳腺癌细胞内bFGF表达机制与以下几方面有关：1)125I粒子释放出X、γ射线破坏bFGF的DNA;2)干扰bFGF合成过程中的转录和翻译;3)X、γ射线破坏bFGF蛋白，使其变性从而失去活性;4)干扰bFGF与受体结合后的信号传导。

　　【参考文献】

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　　[3] 许进，周序珑，夏明汗，等.乳腺癌VEGF、P53表达与肿瘤血管新生和转移的关系[J].临床与实验病理学杂志，2002，18(2)：185-188.

　　[4] 罗开元，赵泉，杨镛，等.125I粒子组织间植入对大肠癌的抑制作用及其机制[J].中华实验外科杂志，2006，23(1)：70-71.

　　[5] 罗开元，毛文源，李波，等.125I 粒子组织间植入治疗恶性肿瘤的疗效观察[J].中华外科杂志，2003，41(2)：122-124.

　　[6] 杨嵘，罗开元，赵泉，等.125I粒子组织间植入联合α1-胸腺肽免疫调节治疗原发性肝癌的疗效评价[J].中国实用外科杂志，2006，26(1)：16-17.

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　　[8] Smith K, Fox SB, White house R, et al. Up regulation of basic fibroblast growth factor in breast carcinoma and its relationship to vascular density,oestrogen receptor,epidermal growth factor receptor and survival[J]. Ann Oncol, 1999,10(6):707-713.