高迁移率族蛋白1在高容量血液滤过防治MODS中的变化及意义

　　作者：沈贤，沈淑蓉，薛向阳，林富林，朱冠保，方国恩 作者单位：1.温州医学院第一附属医院 普外科，浙江 温州 325000

　　【摘要】 目的:通过观察高迁移率族蛋白1(HMGB1)在多脏器功能障碍综合征(MODS)发生过程中的变化趋势，探讨MODS发生机制及高容量血液滤过(HVHF)防治MODS的理论依据。方法:采用失血性休克复苏+内毒素血症复合因素建立猪MODS模型，将19只健康雄性家猪随机分成MODS组和HVHF组，HVHF组动物内毒素注射后予血液滤过，血滤采用F50聚砜膜滤器，超滤量3 L/h。Western blot法检测血浆HMGB1蛋白含量变化，并通过与各自基础值的比较，了解HMGB1蛋白相对变化趋势。结果:HVHF组2例发生MODS，占20%(2/10)，显著低于MODS组88.9%(8/9) (P<0.01)，主要器官功能明显改善。HMGB1蛋白水平于内毒素注射后1 h无明显升高，至24 h两组均显著升高，后呈缓慢下降趋势。HVHF组，HMGB1蛋白相对于基础值水平升高幅度明显低于MODS组。结论:HMGB1蛋白等炎症介质的过度表达是MODS发生的本质原因之一;HVHF能够降低血循环中HMGB1等炎症介质的峰值浓度，有效遏制过度的炎症反应，防止MODS发生。

　　【关键词】 多器官功能衰竭;血液滤过;HMGB1蛋白

　　The fluctuation and significance of HMGB1 in MODS prevented and treated with high volume hemofiltration SHEN Xian*, SHEN Shu-rong, XUE Xiang-yang, LIN Fu-lin, ZHU Guan-bao, FANG Guo-en. *Department of General Surgery,the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College,Wenzhou,325000

　　Abstract: Objective: To explore the pathogenesis of MODS and the role of HVHF in preventing and treating MODS through observing the fluctuation of high mobility group-1 protein (HMGB1). Methods: Double-hit method was used to establish the porcine MODS model. Nineteen healthy male minipigs were randomly divided into MODS group and HVHF group that underwent prophylactic high-volume hemofiltration(3 L/h) after injection of LPS. F50 polysulfone membrane filter was used. Plasma levels of HMGB1 were detected with Western immunoblot analysis,and its tendency was observed through comparing with base level. Results: The mobidity of MODS in group H was 20%(2/10), much lower than that in group M (88.9%,8/9) (P<0.01). Main organ functions were improved by HVHF. And the plasma level of HMGB1 obviously elevated in both group 24 hour after the endotoxin injection, then started to drop slowly. In group H, the peak of HMGB1 protein correspond to base level was lower than that in group M. Conclusion: Excessive release of inflammatory cytokines, including HMGB1 protein is one of the essential pathogenesis of MODS. HVHF can prevent and treat MODS through cutting down the peak value of inflammatory cytokines, including HMGB1 protein, restraining excessive inflammatory responses.

　　Key words: multiple organ failure; hemofiltration; HMGB1 protein

　　高迁移率族蛋白1(high mobility group-1 protein，HMGB1)为新近发现的一种晚期炎症介质[1]，参与了脓毒症所致多器官损害的发病过程。而高容量血液滤过(high volume hemofiltration，HVHF)能通过削弱血循环中炎症介质的峰值浓度，重建机体免疫系统的内稳态，防止多脏器功能障碍综合征(MODS)的发生[2]。本研究试图从HMGB1角度出发探讨MODS的发生机制及HVHF防治MODS的理论依据。

　　1 资料和方法

　　1.1 主要试剂和仪器 F50聚砜膜血液过滤器(德国Fresenius公司产品)，鼠抗猪HMGB1单克隆抗体(美国Stressgen公司产品)，HRP标记二抗(上海华美生物公司产品)，NBT/BCIP显色液(上海华美生物公司产品)，硝酸纤维素膜(德国Schleicher & Schuell公司产品)，Phamacia电泳仪(瑞士Phamacia公司产品)。

　　1.2 实验动物分组及模型建立 失血性休克复苏+内毒素血症复合因素建立猪MODS模型[3]。体重22～30 kg健康雄性家猪被随机分为2组：MODS组(M组)9只，HVHF组(H组)10只。H组动物内毒素注射后予床边血液滤过，放血前、内毒素注射前、内毒素注射后1 h、24 h、48 h及96 h(处死前)留取血标本。

　　1.3 HVHF 内毒素注射完毕后开始HVHF，采用BP-21型自弹式血泵、F50聚砜膜滤器(膜面积1.0 m2)，血流量200 ml/min，超滤量根据全天治疗量和生理需要量设定，前稀释法输入。连接前血路管道先用5 000 IU/L的肝素生理盐水循环30 min，肝素以1 500 IU/h持续抗凝。治疗持续时间为12 h，12 h后更换滤器，共3 d。

　　1.4 Western blot法检测血浆HMGB1蛋白含量变化 T1～T6时间点各取30μl经冷冻抽干浓缩后血浆样本上样进行SDS-PAGE电泳，将蛋白从凝胶转移到硝酸纤维素膜上，3%的脱脂奶粉室温封闭30 min后与适当稀释的一抗(鼠抗猪HMGB1单抗)室温反应2 h，漂洗后与适当稀释的第二抗体(羊抗鼠IgG-AP二抗标记)室温反应2 h，BCIP/NBT底物显色。

　　1.5 图像分析及数据处理 采用Labworks4.6版本UVT明胶扫描软件测定每组样本蛋白表达的灰度值，分别计算出与各自T1时间点的比值，以此反映HMGB1蛋白相对基础值水平的变化趋势。

　　1.6 统计学处理方法 数据以±s表示，采用SPSS11.5统计软件行统计学处理，两组均数比较采用t检验，MODS的发生情况比较采用Fisher确切概率法检验。

　　2 结果

　　2.1 M0DS发生情况及主要器官功能变化 M组8例发生MODS，占88.9%(8/9)，H组2例发生MODS，占20%(2/10)(P<0.01)。H组平均动脉压(MAP)和心率等生命体征得到明显改善，处死前PaCO2、肺动脉楔压(PAWP)、AST及BUN等指标较M组均明显下降，PaO2明显上升，与M组比较，差异具有显著性(表1)。

　　2.2 血浆HMGB1蛋白表达水平的变化 血浆HMGB1蛋白表达水平于内毒素注射后1 h(T3)升高不明显，至24 h(T4)时间点两组均显著升高，48 h(T5)时间点开始下降(图1，图2);通过与各自基础值T1时间点比较，发现HVHF组HMGB1蛋白相对于基础值水平升高幅度明显低于MODS组，差异具有显著性(P<0.01)(图3)。

　　3 讨论

　　HVHF是在连续性肾脏替代治疗(CRRT)的基础上发展起来的，即通过增加置换液输入量进一步提高对大中分子溶质的对流清除。近几年的动物实验和临床研究均显示，与传统的CRRT相比，在感染性休克及MODS的治疗中，HVHF 能更加明显地改善血流动力学状态，减少正性肌力药物的用量，调节免疫平衡，改善脏器功能，降低MODS的发生率和病死率[4,5]。HVHF对细胞因子清除的分子量截留点为30～50 kD，由于血液滤过主要依靠对流原理清除溶质，根据滤器的截留分子量，理论上50 kD以下的中分子量物质可以被清除，而主要炎性细胞因子多在50 kD以下，其中HMGB1分子量为30 kD，完全可以通过对流原理被清除。

　　HMGB1广泛分布于高等真核生物细胞核中，受内毒素等刺激可分泌至细胞外，作为炎症介质参与脓毒症的病理生理过程。HMGB1因其产生较IFN-γ和TNF-α等早期细胞因子晚，且持续时间较长，故有“脓毒症晚期介质”之称[1]。本实验发现，MODS组外周血HMGB1蛋白表达水平于内毒素注射后1 h升高不明显，至内毒素注射后24 h已显著升高，48 h未见明显下降，处死前可见明显下降，但仍高于内毒素注射前水平，该变化符合HMGB1作为晚期炎症因子的代谢规律[6]。国内张立天等[7]观测了严重烫伤及盲肠结扎穿孔致脓毒症模型小鼠肝、肺等重要脏器HMGB1 mRNA的表达变化，发现HMGB1 mRNA水平在损伤后24 h开始显著升高，一直持续到损伤后72 h，并观察到HMGB1 mRNA表达水平与脏器功能损害密切相关，与本试验结果基本相符。处死前HMGB1呈现明显的下降趋势，可能与机体针对过度的炎症反应分泌PGE2、糖皮质激素等免疫抑制介质相关[8，9]，以往研究显示脓毒症晚期机体往往存在免疫抑制状态[10]。

　　Ulloa L等[11]研究发现，血浆HMGB1蛋白水平与脓毒症严重程度及疾病进展密切相关。本试验HVHF治疗组，HMGB1蛋白相对于基础值水平升高幅度明显低于MODS组，说明HVHF能够降低血浆HMGB1蛋白水平，在一定程度上改善病情。而在脓毒症病程进展中，免疫反应的激活与级联放大依赖于众多炎症因子的共同参与，构成一个复杂的网络[12，13]，单一阻断某一因子效果并不理想，迄今尚无一种炎症介质拮抗剂能够通过Ⅲ期临床试验[14]，而通过血液滤过可以削弱血循环中大多数炎症介质的峰值浓度，重建机体免疫系统的内稳态。HMGB1蛋白在血浆中维持时间较长，能够较好得反映机体炎症反应的强度，而TNF-α等早期炎症因子在MODS晚期早已恢复至正常水平[14]，难以反映当时机体的免疫状态。通过动态监测血浆HMGB1蛋白水平，选择合适的时机进行滤过干预，可以有效地遏制过度的炎症反应，防止MODS发生。

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