人脐血干细胞移植治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎的研究

作者：潘凤华，丁海霞，丁新生，王辉，张智弘   

作者单位：210011南京医科大学第二附属医院神经内科

 【关键词】  人脐血干细胞; 移植; 实验性自身免疫性脑脊髓炎

    Study on human umbilical cord blood cells transplantation for treatment of experimental autoimmune encephalomyelitis  PAN Fenghua, DING Haixia,DING Xinsheng,et al.Department of Neurology, the Second Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210011, China

    Abstract：Objective  To explore the effects of human umbilical cord blood cells (HUCBCs) transplantation to treat experimental autoimmune encephalomyelitis(EAE) rats and the status of transplanted HUCBCs in the  brain and spinal cord tissue of EAE rats.Methods  The mononuclear cells abstracted from cord blood of infants were cultured in vitro and marked with 5bromodeoxyuridine (Brdu) for 48 h. EAE rat models were made and the HUCBCs (3×106 ) were transplanted into the tail vein(transplanted group) 14 d later. The score of neurological function dificit and the number of the demyelinated foci in brain and spinal cord were undertaken at different time point after transplantation. The statue of survival, differentiation and migration of HUCBCs in vivo were determined by immunohistochemical technique, and compared with control group. Results  The scores of neurological function dificit at 21 d,28 d post transplantation in transplanted group were much lower than those in the control group ( all P<0.05). Within the brain and spinal cord tissues, Brdu reactive HUCBCs were distributed throughout the lesions at every time point after transplantation and were differentiated into astrocytes, oligodendrocytes and neurons in vivo 14 d, later. More Brdu reactive cells were found in the brain and spinal cord tissues at 21 d, 28 d than those at 7 d and 14 d ( all P<0.05). Compared with control group, the number of demyelinated foci decreased significantly at 14 d after transplantation (all P<0.05). Conclusion  HUCBCs transplantation can effectively improve the neurologic function of EAE rats，the HUCBCs may survive, migrate and differentiate in the brain and spinal cord tissues of EAE rats, reduce demyelinated focis.

    Key words：human umbilical cord blood cells; transplantation; experimental autoimmune encephalomyelitis

    实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE)的临床表现、病理改变、免疫学特点与多发性硬化（MS）相似,是研究MS发病机制和治疗方法的动物模型［1］。脐血中富含造血干/祖细胞，人脐血干细胞（HUCBCs）移植治疗神经系统疾病的应用前景广阔。本实验从神经功能缺损评分、免疫组化检测及髓鞘染色病灶数目3个方面对HUCBCs移植治疗EAE大鼠的效果进行研究，以探讨尾静脉移植HUCBCs治疗EAE大鼠的可行性。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    1.1.1  动物与分组  成年雄性Wistar大鼠40只,质量200～250 g；豚鼠6只，质量300～350 g；均由上海实验动物中心提供。大鼠随机分为HUCBCs移植组(20只)和对照组(20只)。

  1.1.2  主要试剂与仪器  (1)试剂:人淋巴细胞分离液(1.077,天津产)，人红细胞裂解液、细胞培养试剂DMEM/F12 (1∶1）、B27 添加剂(Gibco)、5溴脱氧嘧啶尿苷(Brdu,Sigma公司),抗生素抗真菌复合物(青霉素、链霉素、两性霉素, Gibco); 完全弗氏佐剂(Sigma公司),结核分支杆菌(南京胸科医院),百日咳杆菌(北京生物制品研究所)。小鼠抗人巢蛋白(nestin)单抗(BD公司),小鼠抗人神经元特异性烯醇化酶(NSE)抗体、小鼠抗人胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体、小鼠抗人2, 3环核苷酸磷酸二脂酶(CNPase)抗体、抗Brdu抗体(Sigma公司)。( 2)仪器: 匀浆机，超净台,细胞培养箱,倒置显微镜（XDS18，Olympus）。

    1.2  方法

    1.2.1  EAE大鼠模型的制作  参照林泓怡等［2］所介绍的方法,将豚鼠处死并经75%乙醇浸泡后,无菌条件下迅速取脊髓组织与等量无菌生理盐水混合匀浆,然后与等体积完全弗氏佐剂制成诱导乳剂。给大鼠足跖皮下注射0.3 ml诱导乳剂进行免疫,7 d后再次注射等量乳剂。注射后所有大鼠每天称体质量，进行神经功能缺损评分；0分：不发病;1分：尾部肌张力降低或轻度步态笨拙;2分：尾部无肌张力,和/或中度步态异常,和/或不能维持姿态;3分：肢体无力;4分：肢体瘫痪;5分：频死状态。≥1分为成功模型。

    1.2.2  HUCBCs悬液制备  参照Ha等［3］的方法采集足月新生儿脐带血60～100 ml,分离脐血单个核细胞,以1×106/ml的密度接种于含10 ml DMEM /F12的培养皿中,用Brdu标记,置于含5%CO2的细胞培养箱中培养48 h后，用PBS反复洗涤离心制备密度为6×106/ml的HUCBCs悬液。

    1.2.3  HUCBCs的移植  移植前HUCBCs经Brdu(终浓度5 μmol/L)标记2 d,离心后将其溶于生理盐水中,调整细胞浓度为6×106/ml。在造模后14 d将大鼠麻醉、固定后,用4.5号头皮针经尾静脉缓慢注入500 μl细胞悬液，留针5 min后缓慢拔针。对照组用同样方法注入等量生理盐水。

    1.2.4  免疫组化检测  分别于HUCBCs移植后7 d、14 d、21 d、28 d随机处死移植组及对照组各5只大鼠。4%多聚甲醛500 ml经左心室灌注后,断头取脑和脊髓,置4%多聚甲醛后固定24 h,冠状位切取大脑顶叶皮质、侧脑室周围、脑干、小脑皮质及脊髓厚度2 mm的组织标本,石蜡包埋,连续切片,片厚5 μm, 进行nestin、Brdu、NSE、GFAP、CNPase 免疫组化染色,观察移植后大鼠脑和脊髓内HUCBCs的存活、增殖、分化、迁徙状况。

    1.2.5  病理学检查  取上述各组大鼠各部位脑组织的切片同时行HE染色和丽春红染色，光镜下行病灶计数。呈袖套样改变或＞20个炎性细胞浸润者为1个脱髓鞘或炎性灶，将各节段所有病灶相加取均数。

    1.2.6  统计学方法  检测数据以均数±标准差(±s)表示,使用SPSS 11.0软件进行统计学分析。

    2  结  果

    2.1  移植组与对照组各时间点神经功能缺损评分的比较  见表1。移植组在移植后1 d、7 d、14 d的神经功能缺损评分与对照组比较差异无统计学意义,但移植后第21 d、28 d的神经功能缺损评分明显低于对照组(均P<0.05)。表1  移植组与对照组移植后不同时间神经功能缺损评分的比较 注：与对照组比较*Ｐ<0.05

    2.2  HUCBCs移植后大鼠脑和脊髓内免疫组化检测结果  移植后7 d、14 d、21 d、28 d的脑和脊髓组织切片中均可见Brdu染色阳性细胞分布,以侧脑室周围、脊髓白质与软脊膜静脉交界处为密集。对同一部位切片Brdu 染色阳性细胞数进行比较, 移植后21 d、28 d明显多于移植后7 d、14 d(均P<0.05), 而7 d与14 d、21 d与28 d之间差异无统计学意义，见表2。各时间点脑和脊髓组织切片均可见nestin染色阳性细胞，移植后7 d大鼠脑和脊髓组织切片中未见GFAP、CNPase及NSE染色阳性细胞，移植后14 d大鼠脑和脊髓组织切片中GFAP、CNPase及NSE均呈弱阳性，移植后21 d、28 d大鼠脑和脊髓组织切片中可见GFAP染色阳性的星形胶质细胞、CNPase 染色阳性的少突胶质细胞、NSE染色阳性的神经元,均以侧脑室周围、脊髓白质与软脊膜静脉交界处为多见，其中以CNPase染色阳性的少突胶质细胞最多，其次为GFAP染色阳性的星形胶质细胞，NSE染色阳性的神经元数量最少。见图1。对照组未见各免疫组化染色阳性细胞。表2  移植组移植后不同时间脑和脊髓中Brdu 染色注：与移植后7 d比较* P<0.05

  2.3  移植组HUCBCs移植后不同时间与对照组大鼠脑和脊髓脱髓鞘病灶数比较  见表3。移植组移植后7 d脑和脊髓脱髓鞘病灶数与对照组相比差异无统计学意义, 移植后14 d、21 d和28 d脑及脊髓中脱髓鞘病灶数显著少于对照组（均P<0.05)。见图2。表3  两组移植后不同时间脑和脊髓脱髓鞘病灶数比较 注：与对照组比较* P<0.05

    图1  移植组大鼠A：侧脑室周围、B：脊髓白质有较多Brdu阳性的HUCBCs（胞核呈棕褐色）；C：侧脑室周围有nestin阳性的HUCBCs；D：CNPase阳性的少突胶质细胞（胞浆呈棕褐色）（免疫组化染色，×400）

    图2  A：对照组大鼠脊髓白质见多处髓鞘脱失及炎性灶； B：移植组大鼠脊髓白质髓鞘脱失明显轻于对照组（丽春红染色，×100）

    3  讨  论

    近年来国内外学者对神经系统疾病的细胞替代治疗进行了一系列探索，发现神经干细胞（NSCs）、脐血干细胞为有效的细胞替代来源［46］，特别是后者具有来源丰富、取材方便、低免疫源性等优点而受到青睐。既往研究［7］证明HUCBCs能够在体内外增殖；植入脑缺血大鼠体内后具有NSCs的特性，在微环境信号的诱导下能分化为神经元、星形胶质细胞以及少突胶质细胞；并能显著改善模型动物的神经功能。

    MS是以中枢神经系统白质脱髓鞘病变为特点的自身免疫性疾病，经典的EAE动物模型被用于MS的研究。2003年Pluchino 等［8］将NSCs通过尾静脉或侧脑室注射移植入EAE小鼠模型,发现植入的NSCs能迁徙到脱髓鞘的白质部位并增殖分化;在损伤区启动髓鞘修复程序,刺激髓鞘再生,促进神经功能修复。HUCBCs具有与 NSCs类似的生物学特性，Dasari等［9］的研究表明，HUCBCs植入脊髓损伤大鼠模型后可分化为神经元、星形胶质细胞以及少突胶质细胞；超微结构分析发现损伤区域轴突的髓鞘结构得以再生；植入后14 d大鼠神经功能明显改善。在分子水平证实源于HUCBCs的少突胶质细胞在损伤区域分泌神经营养因子3（NT3）、脑源性神经营养因子（BDNF），合成髓鞘碱性蛋白（MBP）、蛋白脂质蛋白（PLP），从而促进髓鞘再生。并用荧光原位杂交方法显示NT3、BDNF、MBP、PLP的mRNA表达明显提高。此研究奠定了HUCBCs移植治疗EAE的实验基础。

    本实验将HUCBCs植入免疫后14 d已发病的EAE大鼠，发现自植入后第21 d起移植组大鼠的神经功能缺损评分明显低于对照组（均P<0.05），表明HUCBCs移植可改善其神经功能。进一步的免疫组化检测结果显示自移植后7 d起，移植组大鼠的侧脑室周围以及脊髓白质与软脊膜静脉交界处可见数量较多的Brdu、nestin 、GFAP、CNPase及NSE阳性细胞分布，表明植入的HUCBCs在免疫炎症微环境信号的诱导下向病灶部位迁徙并增殖，并具有NSCs的特性，可分化为神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞。各免疫组化染色阳性细胞以移植后21 d、28 d明显多于移植后7 d、14 d，说明其迁徙和分化需要一定的时间。在既往的实验研究［7］中，发现植入的HUCBCs分化为星形胶质细胞的比例最多，而本实验结果显示CNPase染色阳性的少突胶质细胞最多，且移植后14 d、21 d、28 d脑和脊髓组织脱髓鞘病灶数明显少于对照组（均P<0.05），说明植入细胞在病变局部微环境信号的诱导下具有定向分化为少突胶质细胞的能力，并能修复损伤区域轴突的髓鞘结构。本实验中所用的nestin、GFAP、CNPase、NSE抗体具有高度的特异性,与大鼠神经组织无交叉反应,排除了病变大鼠自体干细胞增殖、分化对实验结果的影响。

    综上所述, HUCBCs移植入EAE大鼠后具有增殖、迁徙和分化的能力, 并较多分化为髓鞘形成细胞——少突胶质细胞，能促进髓鞘再生，减少脱髓鞘病灶数,改善神经功能，为神经系统自身免疫性疾病的治疗带来了希望。

【参考文献】  ［1］ Edward JF.Immunopathology of multiple sclerosis［J］.Neurology,2004,63(Suppl 6):S3.

［2］ 林泓怡,李跃华,郭琳,等.实验性自身免疫性脑脊髓炎动物模型的改良［J］.南京医科大学学报,2003,23:235.

［3］ Ha Y, Choi JU, Yoon DH, et al. Neural phenotype expression of cultured human cord blood cells in vitro ［J］. Neuroscience, 2001, 12:3523.

［4］ 潘凤华,李晓波,丁新生,等.人胚神经干细胞移植治疗大鼠脑缺血的实验研究［J］.临床神经病学杂志,2005,18:84.

［5］ 丁海霞, 潘凤华, 丁新生,等. 人胚神经干细胞移植治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠的实验研究［J］.南京医科大学学报(自然科学版),2006,26:161.

［6］ GarbuzovaDavis S,Willing AE,Zigova T,et al.Intravenous administration of human umbilical cord blood cells in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis:distribution,migration and differentiation［J］.J Hematother Stem Cell Res,2003,12：255.

［7］ 潘凤华,李晓波,丁新生,等.人脐血干细胞移植治疗大鼠脑缺血的实验研究［J］.临床神经病学杂志,2006,19:121.

［8］ Pluchino S, Quattrini A,Brambilla E,et al.Injection of adult neurospheres induces recovery in a chronic model of multiple sclerosis［J］.Nature,2003,422:688.

［9］ Dasari VR,Spomar DG,Gondi CS,et al.Axonal remyelination by cord blood stem cells after spinal cord injury［J］.J Neurotrauma,2007,24:391.