外周血表皮生长因子受体mRNA表达对大肠癌微转移和预后的临床意义
发表时间:2010-08-25 浏览次数:377次
作者:肖钟迪 梁春林 陈志奇 康德新 和利稼 白山 王勋 黄海涛 作者单位:大庆油田总医院普外科,黑龙江 大庆 163001
【摘要】 目的 检测大肠癌患者外周血中表皮生长因子受体(EGFR)并分析其临床意义。方法 应用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)检测37例大肠癌及40例大肠良性病变患者外周血EGFR mRNA。结果 40例大肠良性病变患者外周血EGFR均为阴性。患者组EGFR mRNA表达阳性为45.9%(17/37)。EGFR mRNA表达阳性者在大肠癌Ducke′s分期中为A期28.6%(2/7),B期31.3%(5/16),C期80.0%(8/10),D期50.0%(2/4);病理上低未分化(63.2%)及中高分化(28.7%)癌间经χ2检验有显著差异(P<0.05)。结论 RTPCR方法检测大肠癌患者外周血中EGFR mRNA表达与其临床及病理分期相关,此项指标检测可作为大肠癌微转移及预后的参考指标。
【关键词】 大肠癌 外周血 表皮生长因子受体
肿瘤的微转移及复发是影响其预后的重要因素,血液中肿瘤细胞的存在是肿瘤血性转移的物质基础,如何早期发现大肠癌患者血液中的肿瘤微转移是临床上比较棘手的问题。它不仅对判断大肠癌的转移和复发具有重要意义,而且对指导临床综合治疗也有重要价值〔1,2〕。本研究应用逆转录-聚合酶链反应(RTPCR)检测37例大肠癌患者外周血中的表皮生长因子受体(EGFR) mRNA的表达,并探讨其与大肠癌微转移及预后的临床病理关系。
1 材料与方法
1.1 临床资料
患者组为我院住院大肠癌37例,男23例,女14例,年龄58~72 岁,平均(63±8)岁。每例术前3 d采外周静脉血5 ml,按1∶9比例加入枸橼酸钠混匀抗凝,立即送检。对照组为大肠良性病变患者40例,均排除合并有其他部位肿瘤的可能,采血方法同上。
1.2 试剂与方法
应用巢式PCR反应,试剂由上海生工生物公司提供。
1.2.1 标本制备
每份抗凝血按1∶1比例加入到淋巴细胞分离液上,2 000 r/min离心20 min,取单核细胞层和中性粒细胞层,用生理盐水洗涤3次,保存于-80℃备用。
1.2.2 总RNA提取
采用非超离心一步法。
1.2.3 逆转录反应
5×buffer 4 μl,AMV 20 u,随机6聚体引物100 pmol/L,10 mmol/L dNTP 2 μl,RNasin 20 u,10 μg标本总RNA。反应体系20 μl。逆转录:42℃ 55 min,95℃ 5 min。
1.2.4 PCR反应
选取EGFR的mRNA作为检测对象,同时检测β肌动蛋白(βActin)作为检测合格的标志。本文根据国内外文献报道及这两个基因的特点设计引物如下〔3,4〕。
1.2.4.1 EGFR引物序列
为了增强反应的特异性及灵敏度笔者采用巢式PCR。
A:5′TCTCAGCAACATGTCGATGG3′;B:5′TCGCACTTCTTACACTTGCG3′;C:5′TCACATCCATCTGGTACGTG3。
第一轮扩增用引物A和B,产生473 bp;第二轮扩增用引物A和C,产生322 bp。
1.2.4.2 β肌动蛋白引物序列
上游引物 5′CACTGTGTTGGCGTACAGGT3′;下游引物 5′TCATCACCATTGGCAATGAG3′。扩增产物154 bp。
1.2.4.3 反应体系
10×buffer 5 μl,引物2 μl,5 mmol/L dNTP 5 μl,TaqDNA聚合酶2.5 u,逆转录产物10 μl,反应体系50 μl。
1.2.4.4 PCR反应程序
β肌动蛋白:94℃ 1 min,58℃ 1 min,72℃ 1 min,以上3个温度共进行35个循环,最后72℃延伸10 min。EGFR:第一轮扩增95℃ 1 min,72℃ 2 min,以上2个温度共进行30个循环,最后72℃延伸10 min;第二轮扩增95℃ 1 min,69℃ 1 min,72℃ 1 min,以上3个温度共进行30个循环,最后72℃延伸10 min。
1.2.5 PCR产物分析
扩增产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳鉴定,用溴化乙锭(EB)染色在紫外灯下观察结果。
1.3 统计学处理
计数资料采用SPSS13.0软件进行χ2检验。
2 结 果
40例大肠良性病变患者(对照组)外周血EGFR均为阴性,大肠癌患者组EGFR mRNA表达阳性为45.9%,两组对比差异显著(P<0.01)。EGFR mRNA阳性表达在大肠癌Ducke′s分期中为A 期28.6%,B期31.3%,C期80.0%及D期50.0%。其中A期和B期,C期和D期组间比较P>0.05,无显著差异。B期和C期组间比较P<0.05,有显著差异。EGFR mRNA表达阳性在低未分化(C+D)及中高分化(A+B)癌组间比较P<0.05,有显著差异(表1)。表1 大肠疾病患者外周血EGFR mRNA表达阳性与临床病理关系(略)注:( )内为%
3 讨 论
恶性肿瘤细胞最显著的特征之一是自主性生长,从1869年外周血中发现恶性肿瘤细胞以来,肿瘤的微转移逐步受到人们的重视,微转移一般指非血液系统的恶性肿瘤在发展过程中,播散并存活于血循环、淋巴系统、骨髓等组织器官的微小肿瘤细胞灶。常无任何临床症状,常规方法如CT、B超、MRI、普通病理检查等很难发现。微转移的转归取决于肿瘤细胞的生物学特性、机体的免疫状态及宿主器官的状态等。发生微转移的肿瘤细胞大多数在形态和功能上与原发灶无差异。有研究表明71例大肠癌伴淋巴结微转移患者中38%在5年内有远处转移或复发,而37例无微转移的患者均无复发〔5〕。微转移虽小,但有发展形成致命的恶行转移的可能〔6〕。
EGFR几乎存在于所有的组织中,在胚胎及胎儿早期的表达较广泛,中期后逐渐与成人的表达趋于一致,这说明EGFR的出现常伴有细胞的增长与分化,在调节人类表皮发育中,起着重要的作用〔7〕。EGFR基因定位于人类第七号染色体短臂上,是一种分子量为170 kD的单链跨膜糖蛋白,其配体为表皮生长因子(EGF)及转化生长因子α(TGFα),其结构分细胞外区、跨膜区和细胞内区三部分。细胞内区具有酪氨酸激酶,EGFR与EGF结合后其构象发生变化,使酪氨酸激酶活性升高,导致受体本身及细胞内酪氨酸残基的磷酸化,后者给细胞提供一个进行细胞分裂的信号,信号通过激酶级联放大传递,在细胞内引起蛋白激酶活化,蛋白质和DNA合成增加等一系列生物效应,从而引起细胞分裂的增殖〔8〕。研究表明,人类许多上皮源性恶性肿瘤组织中存在EGFR表达增强,过度表达的EGFR不断将表皮生长因子的刺激导入细胞内,激活酪氨酸激酶而产生放大生长信号的作用,促进细胞异常增长,在许多上皮性肿瘤中EGFR的表达或过表达为恶性肿瘤的重要特性之一〔9,10〕。
本研究40例正常人外周血中均无EGFR mRNA的表达,表现了EGFR mRNA的特异性。检测到mRNA就意味着表达此种mRNA的肿瘤有活动的完整肿瘤细胞存在。对于癌患者而言,应视为形成远处转移的高危人群,应加强随访,并采取必要的治疗措施。本组大肠癌EGFR mRNA阳性表达为45.9%,大肠癌EGFR mRNA阳性表达病例数在低未分化腺癌为63.2%,中高分化腺癌27.8%,两组比较有显著差异(P<0.05),与低未分化腺癌恶性程度高、转移早相符〔11〕。Duke′s 分期中A、B、C及D期中EGFR mRNA阳性表达分别为A 期28.6%,B期31.3%,C期80.0%及D期50.0%,表明超过B期患者外周血癌细胞检出率高。
恶性肿瘤在发展过程中,肿瘤细胞自原发灶上脱落,经发育不完善、基底膜不完整的新生血管进入血液循环,并在其中存活成为循环癌细胞,血液循环存在癌细胞并非预示转移的发生,但有些循环癌细胞引起转移而影响患者的预后。由于肿瘤未形成转移结节,无任何临床表现,影像学及常规病理检查难以发现,因此利用即敏感又特异的RTPCR检测外周血中EGFR mRNA的表达以判断是否存在循环癌细胞,对于肿瘤的判断预后及指导治疗方案的选择具有重要意义〔12〕。
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