乳腺癌VEGFC mRNA的表达与淋巴结转移的关系

　　作者：王虎霞，盛 薇，王光辉，樊 林，单 涛，赵 伟，李 萌 作者单位：(西安交通大学医学院第一附属医院普外科，陕西西安 710061)

　　【摘要】 目的 探讨乳腺癌血管内皮生长因子C(VEGFC)的表达与乳腺癌淋巴结转移等临床病理指标之间的关系。方法 用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)法检测60例乳腺浸润性导管癌VEGFC mRNA的表达情况，取15例乳腺纤维腺瘤标本作为对照。结果 乳腺癌组VEGFC mRNA的阳性表达率及表达程度明显高于对照组(P均<0.01);乳腺癌淋巴结转移组VEGFC mRNA的表达率及表达程度高于淋巴结非转移组(P均<0.05);VEGFC mRNA的表达与乳腺癌淋巴结转移呈正相关(r=0.638，P<0.01)。结论 乳腺癌中VEGFC mRNA的表达水平增高;VEGFC mRNA的表达促进乳腺癌淋巴结转移。

　　【关键词】 乳腺癌;血管内皮生长因子C mRNA;淋巴结转移

　　Correlation between VEGFC mRNA expression

　　and lymph node metastasis in breast cancerWANG Huxia, SHENG Wei, WANG Guanghui, FAN Lin, SHAN Tao, ZHAO Wei, LI Meng

　　(Department of General Surgery, the First Affiliated Hospital, Medical School of

　　Xian Jiaotong University, Xian 710061, China)ABSTRACT: Objective To study the expression of vascular endothelial growth factor C (VEGFC) in breast cancer and its correlation with clinicopathological indexes of lymph node metastasis. Methods Reverse transcription polymerase chain reaction (RTPCR) method was adopted in detecting VEGFCmRNA expression in 60 cases of breast infiltrative tubular cancer. We took 15 cases of breast fibroadenoma as controls. Results The positive rate and degree of VEGFCmRNA expression were higher in the breast cancer group than in the control group (P<0.01). VEGFCmRNA expression was significantly higher in the lymph node metastasispositive group than in lymph node metastasisnegative group (P<0.05). VEGFCmRNA expression was positively correlated with lymph node metastasis (r=0.638, P<0.01). Conclusion VEGFCmRNA expression was higher in breast cancer and it promoted lymph node metastasis in breast cancer.

　　KEY WORDS: breast cancer; vascular endothelial growth factor C mRNA; lymph node metastasis

　　研究表明，血管内皮细胞生长因子C(vascular endothelial growth factor C, VEGFC)是较特异的促淋巴管内皮生长因子，在乳腺癌淋巴管的生成及淋巴结转移中发挥着不可忽视的作用[1]。目前关于VEGFC基因水平的研究，国内报道较少。本研究通过逆转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chainreaction, RTPCR)法检测乳腺癌组织中VEGFC mRNA的表达，以三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)为内对照对目的基因进行半定量分析，探讨VEGFC基因表达与乳腺癌淋巴结转移之间的关系。

　　1 材料与方法

　　1.1 标本来源 收集西安交通大学医学院第一附属医院2006年3月～2007年5月间乳腺浸润性导管癌新鲜标本60例为研究对象，其中淋巴结转移29例，无转移31例。肿块长径≤2cm 23例，>2cm且≤5cm 30例，>5cm 7例。按WHO乳腺浸润性导管癌病理学分级标准：Ⅰ级19例，Ⅱ级18例，Ⅲ级23例。所有患者均为女性，平均年龄(45.21±8.23)岁，术前均未接受放、化疗等，均行乳腺癌改良根治术，清除淋巴结数目均大于15枚。取门诊乳腺纤维腺瘤新鲜标本15例作为对照。

　　1.2 主要试剂 焦炭酸二乙酯(DEPC)购自Sigma公司;Trizol试剂购自Invitrogen公司;RevertAidTMcDNA第1链合成试剂盒购自MBI公司;2×Taq PCR MasterMix(KT201，含染料)及DNA Markers购自天根生物技术有限公司。引物由北京奥科生物技术有限责任公司合成。VEGFC引物1：ACCAAACAAGGAGCTGGATG，引物2：AAGAGGC

　　CTTTTGCAGATGA，产物长度600bp，退火温度58℃;GAPDH引物1：ATCATCCCTGCCTCTACT

　　GG，引物2：CCCTCCGACGCCTGCTTCAC，产物长度188bp，退火温度58℃。

　　1.3 方法 每例标本术后留取新鲜组织，用处理过的剪刀把组织剪成小块，立即放入1mL/L的DEPC水溶液处理过的冻存管，迅速投入液氮，随后转送实验室，-80℃冰箱保存。取100mg组织，Trizol法提取的总RNA，并进行RNA纯度及完整性测定。按照RevertAidTMcDNA第1链合成试剂盒说明反转录，合成cDNA。取cDNA<1μg(1μL)进行PCR反应，GAPDH为内参照，采取分管扩增，反应体系25μL，退火温度58℃，34个循环。产物经琼脂糖凝胶电泳检测，并送北京奥科生物技术有限责任公司测序。每批实验均设有内参GAPDH作为对照，避免RNA定量误差、加样误差以及各PCR反应体系中扩增效率不均一、各孔间的温度差等所造成的误差。计算目的基因与内参基因吸光度的比值，即目的基因相对表达量，进行半定量比较。同时设有阴性对照，防止非特异性扩增，即①PCR体系不加模板;②PCR体系中只加内参引物而不加目的基因引物。

　　1.4 结果判定 ①RNA纯度及浓度测定：分光光度计读取RNA溶液在260nm、280nm波长的吸光度比值A260/A280即RNA浓度。比值判定：A260/A280在1.8～2.0视为抽取的RNA纯度较高，蛋白质和酚去除较干净，该样品可用于下一步实验。②RNA完整性鉴定：经10g/L琼脂糖凝胶电泳，检测28S和18S条带的完整性和他们的比值。28S和18S条带明亮、边缘清晰、条带锐利，并且28S的亮度在18S条带的两倍以上，认为RNA质量是好的。

　　1.5 统计学分析 实验数值均以±s表示，由SPSS13.0统计分析软件处理。计数资料比较采用χ2检验及Fisher确切概率法，计量资料采用t检验，相关分析用Spearman法。显著性检验水平α=0.05。

　　2 结 果

　　2.1 RNA检测及VEGFC产物测序 本实验经反复提取RNA，每例样品RNA纯度均符合要求。本实验经RNA电泳显示，每例样品RNA质量均符合要求(图1)。产物经纯化和双向测序，VEGFC目的片段符合预期扩增目标，无碱基错配、突变等(图2)。

　　2.2 两组VEGFC mRNA表达率的比较 乳腺癌组VEGFC mRNA的阳性表达率为73.3%(44/60)，明显高于对照组的13.3%(2/15)，差异有统计学意义(P<0.01)。

　　2.3 VEGFC mRNA表达与乳腺癌临床、病理相关参数的关系 乳腺癌淋巴结转移组VEGFC mRNA的阳性表达率(86.2%)高于淋巴结无转移组(61.3%)，差异有统计学意义(P<0.05)。在不同月经状态、肿块大小、病理分级、雌激素、孕激素受体及HER2表达分组中VEGFC mRNA表达均无显著性差异(表1)。表1 VEGFC mRNA表达与乳腺癌临床、病理相关参数的关系

　　2.4 两组VEGFC mRNA表达程度的比较 乳腺癌组VEGFC mRNA的相对表达量(0.561±0.359)明显高于对照组(0.561±0.359)，差异有统计学意义(P<0.01)。乳腺癌淋巴结转移组VEGFC mRNA的相对表达量(0.738±0.309)高于淋巴结无转移组(0.396±0.324)，差异有统计学意义(P<0.01，图3、图4)。VEGFC mRNA表达与乳腺癌淋巴结转移呈正相关(r=0.638，P<0.01)。

　　3 讨 论

　　人VEGFC基因长40kb，定位于4号染色体的长臂3区4带(4q34)上，其VEGFC cDNA的开放阅读框可表达含419个氨基酸残基的蛋白质，分子质量为46.9ku。VEGFC是VEGF家族的一员，首先以前蛋白的形式生成，前蛋白包括一个N端信号肽，随后为VEGF同源区和一个C端前肽，VEGFC的VEGF同源区包含3个与N相连的基化位点[2]。VEGFC前体蛋白为61ku的蛋白二聚体，在细胞内分泌的前蛋白转化酶的作用下可被激活[3]。分泌出来的VEGFC31/29ku亚基以非共价二硫键连接，具有与VEGFR3结合的能力，然后在细胞外环境中被纤维蛋白酶和其他的蛋白酶水解为21ku的非双硫键连接蛋白后，VEGFC同其受体VEGFR3和VEGFR2均具有高度亲和力。

　　研究表明，肿瘤细胞分泌出的VEGFC经丝氨酸蛋白纤溶酶水解，形成活性形式[3]，与表达于淋巴管内皮细胞上的受体VEGFR3结合，引起Shc磷酸化和ERK1及ERK2的活化，促进淋巴管内皮细胞增生，从而使淋巴管增生或扩张，增大肿瘤淋巴道转移的机会[4];并增加脉管的通透性，改变淋巴管内皮黏附特性或表面趋化因子的表达，从而促进肿瘤转移[5]。VEGFC还可诱导新生淋巴管与己存淋巴管愈合，使肿瘤细胞从新生淋巴管进入淋巴结，发生淋巴结转移，并通过淋巴系统向全身其他器官扩散。VEGFC的部分蛋白水解加工形式则只能特异性地与VEGFR3结合，诱导淋巴管生成反应[6]。SKOBE等[7]通过乳腺癌动物模型研究肿瘤源性VEGFC与肿瘤内微脉管生成的关系，结果显示VEGFC仅选择性诱导肿瘤内淋巴管生成，而不引起血管生成反应。日本及我国学者[89]在胃癌的研究中均证实VEGFCmRNA的表达促进肿瘤淋巴管生成及淋巴结转移。KOYAMA等[10]在乳腺癌中的研究得出相同结论，认为VEGFC是预测肿瘤淋巴结转移的重要指标。

　　本研究通过RTPCR法检测乳腺癌组织中VEGFC mRNA的表达，并对其做相对定量检测。结果显示，乳腺癌组VEGFC mRNA表达阳性率及相对表达量均明显高于对照组(P<0.05)，提示VEGFC mRNA在乳腺癌的发病及鉴别中具有重要意义，与文献报道一致[10]。实验还发现，乳腺癌淋巴结转移组VEGFC mRNA表达阳性率及表达程度均明显高于淋巴结无转移组，VEGFC mRNA表达与乳腺癌淋巴结转移呈正相关关系。可见VEGFC促进乳腺癌淋巴管淋巴结转移，这与目前国内外的研究报道一致。同时，VEGFC mRNA表达在不同患者月经状态、肿块大小、病理分级、雌激素、孕激素受体及HER2表达分组中差异无统计学意义，提示VEGFC mRNA是相对独立的乳腺癌预后指标。

　　在本研究中，VEGFC mRNA高表达而未发生淋巴结转移者19例，可能是转移处于亚临床状态或者肿瘤转移还受其他因素的调控;VEGFC mRNA低表达而发生淋巴转移者4例，推测可能除了VEGFC/VEGFR3调控系统外，尚存在其他调控因子介导的淋巴转移机制。有学者认为环氧化酶2(COX2)在肿瘤淋巴管生成中发挥重要作用，关于VEGFC与COX2是否存在相互作用及作用的机制目前尚不清楚[11]。

　　文献显示，在哺乳动物肿瘤细胞使用siRNA技术，使VEGFC的表达水平下调，发现肿瘤淋巴管生成和自发性肿瘤转移明显抑制，动物存活率提高[12]。通过抑制VEGFC的表达或阻断其效应而抑制肿瘤淋巴结转移，将成为一种新的肿瘤治疗模式。然而，也有研究表明肿瘤分泌的VEGFC是淋巴管生成所必须的，但是淋巴管生成并不是淋巴结转移所必须的[13]。VEGFC与肿瘤淋巴结转移的关系及淋巴结转移的具体机制，尚有待于进一步研究。

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