大鼠小肠移植模型的技术改进

　　作者：张立，何纪恩，车向明，樊林，赵伟，于楠 作者单位：西安交通大学医学院：1. 第二附属医院普外科，陕西西安 710004;2. 第一附属医院普外科，陕西西安 710061;3. 第二附属医院教务部，陕西西安 710004

　　【摘要】目的 建立一种更为简便、稳定、存活率高的大鼠小肠移植模型。方法 供、受体手术均双人操作，整体切取供体节段小肠，术中原位冷灌注，4℃ UW液保存;受体采用显微外科技术行带供体小肠的腹主动脉补片与受体腹主动脉端侧吻合，术中经受体左肾静脉行供体特异性输血，利用Cuff套管技术将供体的门静脉与受体的左肾静脉端端吻合。移植肠近端结扎，远端外置。结果 建立小肠移植模型60次，动脉、静脉吻合时间分别为(20±5)min和(2±1)min。52只存活超过3d，存活率为86.7%，平均存活(16±9.4)d，最长存活时间为45d。结论 科学统筹、供体特异性输血和血管吻合技术的改良能建立更为可靠的大鼠小肠移植模型，为进一步的研究奠定了基础。

　　【关键词】 动物模型 小肠移植 血管吻合 供体特异性输血

　　A modified model of small bowel transplantation in rats

　　ZHANG Li, HE Jien, CHE Xiangming, FAN Lin, ZHAO Wei, YU Nan

　　1. Department of General Surgery, the Second Affiliated Hospital, Medical School ofXian Jiaotong University, Xian 710004; 2. Department of General Surgery,the First Affiliated Hospital, Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710061;3. Department of Teaching Affairs, the Second Affiliated Hospital,Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710004, China

　　ABSTRACT: Objective To establish a simple and stable model of small bowel transplantation in rats with high survival rate. Methods Operations on both donors and recipients were performed by two persons, who incised the segment of small bowel consisting of abdominal aorta patch with arteria mesenterica superior pedicle and superior mesenteric vein to portal vein, cold perfused it during operation, and then preserved it in UW solution at 4℃. The endtoside anastomosis of donor abdominal aorta patch with arteria mesenterica superior pedicle and recipient abdominal aorta was performed according to the microsurgical technique, donor specific blood transfusion during the operation, an endtoend anastomosis between the donor portal vein and the left renal vein of recipient using the cuff technique. The proximal end was hypodesmused and the distal end of the graft was exteriorized. Results The establishment of the small bowel transplantation model was made for 60 times, and the operation in anastomosis between arteries and veins lasted for (20±5)min and (2±1)min, respectively. Fiftytwo models survived for more than 3 days, with survival rate of 86.7%, an average survival length of (16±9.4)d and the longest one of 45 days. Conclusion By scientific planning as a whole, donor specific blood transfusion and the modified technique of donor small bowel obtained, the more reliable model of small bowel transplantation in rats has been established, which could lay a foundation for further research.

　　KEY WORDS: animal model; small bowel transplantation; artery anastomosis; donor specific blood transfusion

　　小肠移植作为肠衰竭患者有效的治疗方法[1]，已在实验室和临床方面广泛开展。小肠移植的实验研究和动物模型的建立及改进密不可分，通过不断地动物模型实验，小肠移植才得以应用于临床并取得成功[2]。大鼠是小肠移植基础研究方面理想的实验动物，但技术难度较大，移植成功率较低。作者通过探索，建立了一种稳定的大鼠异位小肠移植模型的制备方法，用来进一步做大鼠同种异体移植时的免疫耐受及相关研究。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物

　　选用雄性SD大鼠(西安交通大学医学院实验动物中心)作为供、受体，体重250～300g，受体略重于供体。

　　1.2 方法

　　1.2.1 术前准备

　　供、受体均至实验室适应性饲养7d，术前禁食12h，自由饮用50g/L葡萄糖盐水。

　　1.2.2 麻醉

　　采用50g/L氯胺酮(江苏恒瑞医药股份有限公司)术前100mg/kg体重腹腔内注射麻醉。

　　1.2.3 供体手术

　　采用双人配合操作，分工明确，术者将大鼠四肢固定取仰卧位，常规消毒腹部，腹部正中切口，上至剑突下至耻骨联合。切开后腹膜，游离肾下腹主动脉并结扎。显露结肠系膜，游离、结扎并切断回结肠动静脉、右结肠动静脉、中结肠动静脉和左结肠动静脉，切除全部结肠。在十二指肠悬韧带下5cm结扎、切断空肠及其系膜，沿肠系膜血管游离近段空肠，并自肠系膜上动脉下将其引至右侧。剪开肠系膜上动、静脉间结缔组织，充分游离肠系膜上动脉。游离腹腔干动脉、右肾动脉和腹腔干动脉与肾动脉间的腰动脉，结扎并切断。游离肠系膜上静脉及门静脉，切除其周围的淋巴结和结缔组织，结扎切断胰十二指肠上、下静脉，将胰腺从门静脉上剥离下来，游离门静脉至肝门。保留20～30cm远端回肠待移植用，余切除。快速结扎、切断脾静脉和幽门静脉，动脉血管夹于腹腔干动脉上阻断腹主动脉[3]，在左肾动脉下方，经腹主动脉插管，以30cmH2O压力行小肠原位灌注。灌注液为4℃UW液，同时将大量生理盐水冰屑敷于小肠上快速降温。灌注开始同时，紧贴肝门部剪断门静脉，灌注至肠系膜和肠壁血管床苍白，门静脉端流出液清亮时，参考樊林等[4]的血管处理方式并予以改进，在供体手术血管灌注满意后，轻轻垂直牵拉肠系膜上动脉，使其与腹主动脉存在一定张力。利用显微弯剪弧度沿肠系膜上动脉根部将腹主动脉弧形剪开，打开后呈一椭圆形动脉瓣补片，明显缩短修剪吻合口时间。

　　助手利用5mL空针在腹腔动脉水平之上逆向穿刺腹主动脉，抽取动脉血约2mL，置于4℃枸橼酸钠抗凝管内保存。将获取的供肠置于4℃ UW液中保存，并将门静脉引入外径2.1mm、内径1.6mm、长4mm的Cuff套管内，翻转静脉内膜于套管外并80无损伤线结扎固定。安装无误时，套管正中可见门静脉圆形开口。术者同时开始受体手术。

　　1.2.4 受体手术

　　于大鼠身下垫一吸水棉垫，体位、消毒、腹部切口与供体相同，盐水纱布保护、包裹受体肠管于腹腔右侧，解剖、游离左肾及其动、静脉。结扎左侧输尿管，近腹主动脉处结扎切断左肾动脉，将左肾翻上留置待用。游离左肾下腹主动脉1.5cm左右。动脉血管夹阻断腹主动脉游离段上、下两端，在其前壁中心用无损伤线缝入并垂直牵引，剪开一长径3mm椭圆形裂孔，并于裂孔上下两端缝置牵引线。助手处理供肠完成后，以冰盐水纱布保护移植肠置入左侧腹腔。将供体腹主动脉补片与受体腹主动脉裂孔以80无损伤线吻合，先缝合前壁，不收紧缝线，使其成螺旋状，待前壁最后一针缝毕，逐一收紧缝线，缝线与牵引线打结，行两侧连续外翻缝合;沿长轴吻合口两端缝合时针距应注意均匀，针距可适当短，此处最易发生漏血;将移植肠管翻转到腹腔的另一侧，用同样的方法缝合后壁，收紧最后一针前，用肝素液冲洗血管腔，防止术后血栓形成。吻合完成后应将移植肠系膜固定2～3针，防止肠管蠕动及体位变化造成系膜血管扭转。动脉吻合后，将复温的供体抗凝血约2mL通过受体左肾静脉远端注入体循环，静脉血管夹于近下腔静脉处阻断左肾静脉，并于远心端横行切开，弃去受体左肾，两根80无损伤线牵引左肾静脉血管残端两侧边，开口剪为倒“T”型，肝素盐水冲入，使之充盈，并将供体带Cuff套管的门静脉插入，顶端不宜超过左肾上腺静脉汇入左肾静脉的平面。检查静脉无扭转后，40无损伤线于Cuff套管上固定。依次快速移除静脉、动脉血管夹，可见移植肠迅速变为鲜红色，肠系膜动脉搏动明显，静脉回流良好(图1)。检查吻合口有无出血，如有少量渗血，可用棉球轻压止血。移植肠近端接扎、封闭，远端于受体大鼠左下腹壁另行开口引出造瘘，后迅速以37℃温盐水行腹腔冲洗、复温。1号线分层关腹。根据术中失血情况，再经阴茎背静脉缓慢推入温热平衡盐水1～3mL。

　　1.2.5 术后管理

　　术后单笼饲养，注意保暖。当日禁食，给50g/L的葡萄糖盐水作为饮用水，次日正常饮食。术后不用免疫抑制剂，存活超过3d者视为手术成功。

　　2 结 果

　　实验鼠麻醉苏醒后可自行翻身爬起，移植肠远端造瘘口可流出乳白色肠液少许。平均手术时间(2.0±0.5)h，热缺血时间(2.0±0.5)min，冷缺血时间(40±10)min，其中动脉吻合时间(20±5)min，静脉吻合时间(2±1)min。

　　行正式异位小肠移植实验60次，8只于2d内死亡，其中5只术中发生低血容量休克，3只不明原因死亡。其余52只存活超过3d，存活率86.7%，48只存活超过5d，占80.0%，最长存活45d。

　　3 讨 论

　　大鼠小肠移植的外科基本技术是MONCHIK和RUSSELL首先描述的，但是亦存在不足之处。大鼠小肠移植是一种较难掌握的显微外科技术。作者根据临床小肠移植实践需要，参照传统方法并加以改进，在如何减少并发症、提高存活率方面，具有一些独到之处，体会如下。

　　3.1 科学统筹，缩短手术时间

　　大鼠小肠移植模型的建立步骤多，注意事项繁杂，而众多实验均强调单人完成。在本实验中我们采用多人配合操作，可以明显缩短手术时间，减少缺血再灌注损伤，确保模型建立成功。如一人解剖供肠及修剪主动脉补片，另外一人开始受体手术，解剖和游离受体腹主动脉和左肾静脉;在血管吻合时，一人在显微镜下操作，另外一人及时替换敷冰，保护肠管等。动物模型的建立本身是为实验研究提供工具的，我们认为移植肠管造瘘近端封闭、远端左下腹造瘘手术操作简单易行、节省时间，建立的动物模型可靠稳定;避免术后发生吻合口漏或者吻合口狭窄，避免移植肠管坏死导致腹腔感染;可以直接观察移植肠术后情况，便于后续实验的活检取材。

　　3.2 供体特异性输血

　　受体在手术过程中因麻醉后血管床扩张、创面蒸发等因素及术后移植肠经历冷保存和再灌注损伤，开放血流后，抗原抗体反应出现，毛细血管床通透性进一步增大，使移植肠呈高分泌状态，使受体极易发生低血容量性休克，所以保证充分的血容量是手术成功的重要因素之一。供体特异性输血指术中在肠管移植的同时，将供体血液注入受体血循环中，从而使受体获得较好的免疫耐受性，提高受体的存活率。传统方法通过阴茎背静脉和皮下注射补液，仅补充晶体而忽视了胶体的缺失。我们在传统方法的基础上，通过术中供体左肾静脉另加输注新鲜血液，更容易恢复血管内血容量和维持血液动力学的稳定[5]，同时能维持胶体渗透压以及可减轻大鼠小肠移植术后急性排斥反应的发生及反应程度[67]。

　　3.3 肠管获取方式的改良

　　在供体手术血管灌注满意后，轻轻垂直牵拉肠系膜上动脉，使其与腹主动脉存在一定张力;利用显微弯剪弧度沿肠系膜上动脉根部将腹主动脉弧形剪开，打开后呈一椭圆形动脉瓣补片，比较樊林等[4]肠系膜根部腹主动脉袖的获取再修剪为补片的方法，时间明显缩短;再采用显微外科技术[8]行带供体肠系膜上动脉蒂的腹主动脉补片与受体腹主动脉端侧吻合，该吻合方式更接近自然生理形态，吻合口宽大，不易狭窄，更符合血流动力学原理，血流不形成涡流，不易形成血栓[4]。

　　综上所述, 采用科学统筹、双人配合、进行供体特异性输血和注意移植肠的获取，即能建立更为简便、稳定、可靠的大鼠小肠移植模型, 为进一步的研究奠定了基础。