多药耐药相关蛋白MRP在胰腺癌细胞中的表达及意义
发表时间：2010-08-20 浏览次数：451次
作者：田文平 郭俊超 作者单位：青海省人民医院普外科;2. 北京协和医院基本外科)
【摘要】 目的 初步探讨多药耐药相关蛋白(multidrug resistance-associated protein , MRP)在胰腺癌细胞中的表达情况及意义。方法 采用反转录多聚酶链反应(RT-PCR)和免疫细胞化学方法，分别在基因和蛋白水平上检测MRP在8株人胰腺癌细胞株(SW1990、PCT-2、PCT-3、PCT-4、Aspc-1、Capan-1、Mia-PaCa-2及Panc-1)中的表达情况。结果 RT-PCR结果显示， MRP存在于所有的胰腺癌细胞株中，平均表达水平为0.44±0.18，在PCT-2细胞中表达水平最低(0.10±0.03);免疫细胞化学结果证实在SW1990、Capan-1和Mia-PaCa-2 三株细胞中MRP蛋白呈弱表达，在PANC-1、ASPC-1、PCT-4和PCT-3细胞中呈较强表达较强，而在PCT-2细胞中呈过度表达。结论 MRP在胰腺癌原发性耐药中可能占有重要地位，在某些时候可能不通过提高转录水平而直接提高翻译产物的表达量而发挥其耐药作用。 田文平(1970～)，男，回族，青海籍，主治医师
【关键词】 胰腺肿瘤 多药耐药 原发性耐药
EXPRESSION AND FUNCTIONAL SIGNIFICANCEOF MULTIDRUGRESISTANCE-ASSOCIATED PROTEINN PANCREATIC ADENOCARCINOMA CELLTian Wenping1 ， Guo Junchao2 (1.Department of General Surgery;2. Department of Surgery)Abstract Objective To detect Multidrug Resistance-associated Protein(MRP) mRNA expression and investigate its significance in pancreatic carcinoma cell lines. Methods Reverse transcription PCR (RT-PCR) and immunocytochemistry (ICC) were carried out to investigate the expression of MRP in 8 human pancreatic carcinoma cell lines (SW1990, PCT-2, PCT-3, PCT-4, Aspc-1, Capan-1, Mia-PaCa-2 and Panc-1). Results MRP/mRNA was present in the 8-pancreatic cancer cell lines, the lowest expression was in PCT-2 (0.10±0.03) detected by RT-PCR. Mild to moderate MRP expression level was found in SW1990, Capan-1 and Mia-PaCa-2. In contrast, Strong MRP expression was shown in PANC-1, ASPC-1, PCT-4 and PCT-3. Interestingly, MRP over expression was also presented in PCT-2 cell. Conclusion All the data showed that MRP might play an important role in mediating multidrug resistance (MDR) of pancreatic carcinoma.
Key words Protein Pancreatic carcinoma Resistance
胰腺癌被认为是具有先天耐药性的肿瘤之一[1, 2]，对目前绝大多数化疗药物均不敏感。有研究发现，胰腺癌细胞中存在耐药基因的先天性表达，并尝试进行逆转，取得了一定的效果[3, 4] 。多药耐药相关蛋白(Multidrug Resistance-associated Protein, MRP)是目前在肿瘤耐药领域研究得最多的耐药相关基因之一。已有文献报道，MRP参与了多种肿瘤细胞的化疗耐药[5, 6]，但其与胰腺癌原发性耐药关系的相关报道尚少。本研究拟通过RT-PCR方法检测MRP mRNA在多株胰腺癌细胞中的表达，并通过免疫细胞化学(ICC)方法检测其耐药相关蛋白在这些细胞中的表达，以期探索胰腺癌先天性耐药机制。
1 材料与方法
1.1 实验材料
8株人胰腺癌细胞株：RNA和蛋白样品由北京协和医院基本外科提供。培养皿、RPMI1640培养基、RNA提取液TRIzo和牛胎血清等细胞培养产品均购自美国Gibco公司。鼠抗人MRP 购于美国Santa Cruz生物公司。 山羊抗小鼠IgG及DAB显色试剂盒购自Dako公司。LabTek 8孔培养板购于美国Costar 公司。Perkin Elmer 2400 PCR 仪为美国PE公司产品，凝胶数字扫描成像系统为美国Kodak公司产品。
1.2 MRPmRNA在胰腺癌细胞株中的表达测定
从Genbank中查到MRP和β-action(肌动蛋白)的基因顺序，按照引物设计的原则，分别将引物设计在不同的外显子上，以免在PCR扩增cDNA时受基因组DNA的干扰。采用PCGENE软件设计出引物：MRP: 5' ACCAAGACGTATCAGGTGGC3', 3' GAGGAGCTGGAACCTGACAG 5' (扩增片段长度：428bp)。β-action: 5' CTGGCCGGGACCTGACTGACT 3', 3' CTAGAAG- CATTTGCGGTGGACGA T5'(扩增片段长度：570bp)。以上引物均由上海生工生物公司合成。通过凝胶数字扫描成像系统进行照相并分析条带吸光度(A)值，以待检基因和β-action条带强度的比值作为目的基因的相对值。
1.3 MRP在胰腺癌细胞株中的表达检测
分别将单层生长于LabTek 8孔培养板中的胰腺癌细胞株用PBS洗3次，加入4%多聚甲醛固定10 min。3%过氧化氢甲醇室温下作用45 min，滴加正常血清封闭液，室温下作用30 min，滴加适当稀释的一抗或PBS，4℃过夜。滴加辣根过氧化酶(HRP)标记的山羊抗小鼠IgG，在37 ℃条件下作用45 min。PBS洗3次，每次5 min。应用DAB显色试剂盒进行显色反应。待显色满意后，用蒸馏水洗涤终止显色。苏木素复染、脱水后，用中性树胶封片待检。结果判断标准：每高倍视野计数100个细胞，阳性细胞在5%以下记为(-), 5%～25%记为(+)，25%～50%记为(+ +)，50%～75%记为(+++)，大于75%记为(++++);当阳性细胞数在(+)时判定为弱表达，在(+)至(+ +)之间时判定为中度表达，若达到(+++)以上时判定为高表达。
2 结果
2.1 MRP基因在胰腺癌细胞株中的表达
MRP扩增的电泳结果见图1，扩增产物大小为428bp。MRP存在于所有的胰腺癌细胞株中，除PCT-2 表达较弱外，其余细胞株扩增条带均较强。
对MRP基因进行半定量分析显示，MRP在大部分胰腺癌细胞株中呈中等水平表达，平均表达水平为(0.44±0.18)。其中PCT-2细胞相对表达水平最低(0.10±0.03)，其次为Mia-PaCa-2(0.26±0.06);剩余6株细胞中MRP的相对表达水平在0.5左右。
2.2 MRP蛋白在胰腺癌细胞株中的表达
免疫细胞化学结果证实，MRP主要着色于细胞核，细胞浆亦有表达。MRP存在于所有的胰腺癌细胞株中，在PANC-1、ASPC-1、PCT-4、PCT-2和PCT-3中的表达较高，表达强度介于(+ +) ～(+ + +) 。与RT-PCR结果不同，在PCT-2细胞中虽然MRP# mRNA水平较低，但其蛋白产物却呈高水平表达，表达强度为(+++)，见图2。
3 讨论
1992年Cole等[6]在阿霉素诱导的小细胞肺癌耐药细胞株H69AR中发现了多药耐药相关蛋白。MRP基因定位于16p13.1，mRNA全长6.5kb，编码1531个氨基酸，分子量为190kDa。与P-gp功能相似，MRP也可以作为活跃的药物外流泵选择性地将某些化疗药物排出细胞外，它的作用底物是与白三烯4、谷胱甘肽、葡萄糖醛酸酯和硫酸盐等结合的复合物及阴离子残基。MRP在血液系统肿瘤中的表达水平较高，组织学研究也提示MRP在许多实体肿瘤中呈先天性表达，且发现在许多P-gp阴性的肿瘤细胞中表达。有研究证实原发性肝细胞癌(HCC)多药耐药和MRP表达有关，HCC耐药起源于内源性多药耐药，MRP可作为预测HCC化疗敏感性的参考指标。MRP 为一种能量依赖性药物外排泵，可将化疗药物泵出细胞导致多药耐药的发生。
在本研究中，RT-PCR结果显示MRP/mRNA在测定的所有胰腺癌细胞株中表达水平均较高，尤其在PCT-2、PCT-3、Aspc-1和PANC-1中，MRP的表达水平大于0.5。在蛋白水平上，除PCT-2细胞外，ICC检测的结果与RT-PCT结果一致。在PCT-2中，MRP/mRNA低表达，但其蛋白的表达水平却较高，说明MRP在某些时候可以通过不提高转录水平而直接提高翻译产物的表达量发挥其耐药作用。
Miller[7]等采用Western 印迹杂交和功能实验的方法分析了胰腺癌细胞株AsPc-1、Capan-1、BxPC-3、PANC-1中P-gp和MRP的表达，结果显示在4株细胞中P-gp的表达水平极低，而MRP的表达水平则较高，因此认为MRP可能是大部分胰腺癌细胞产生先天性耐药的主要原因。本实验对多株胰腺癌细胞株测定所得的结果也显示了MRP在参与胰腺癌先天性耐药活动中的重要作用。
【参考文献】
1] Priebe, TS, Atkinson EN, Pan BF, et al. Intrinsic Resistance to Anticancer Agents in the Murine Pancreatic Adenocarcinoma PANC02[J]. Cancer Chemother Pharmacol， 1992，29： 485-89
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[3]郭俊超， 阎长青， 廖泉，等. 肺耐药蛋白在胰腺癌细胞中的表达及意义[J]. 中国普外基础与临床杂志，2006, 13(5): 502-55
[4]郭俊超， 赵玉沛， 廖泉，等. 多药耐药相关基因及其蛋白在介导胰腺癌细胞原发性耐药中的作用及调控[J]. 中华外科杂志, 2007, 11(45):1488-1490
[5]Ikuta K, Takemura K, Sasaki K，et al. Expression of multidrug resistance proteins and accumulation of cisplatin in human non-small cell lung cancer cells[J]. Biol Pharm Bull， 2005, 28(4):707-12
[6]Cole S.P.C, Bhardwaj G, gerlach JH, et al.Overexpression of a transporter gene in a multidrug-resistant human lung cancer cell line[J]. Science，1992， 258, 1650-1654
[7]Miller DW, Fontain M, Kolar C, et al. The expression of multidrug resistance-associated protein (MRP) in pancreatic adenocarcinoma cell lines[J]. Cancer Lett，1996, 107(2):301-306
