大鼠脑出血后MMP9对血管生成影响

作者：方李鸿 娄季宇 白宏英 曾志磊 仲玉洁 刘海涛 郭耀强    作者单位：郑州大学第二附属医院神经内科 郑州 450014 　　【摘要】  目的 探讨脑出血后MMP9对血管生成的影响。方法 采用立体定向技术作大鼠脑出血模型，用免疫组化方法测定脑出血后CD34阳性新生微血管及MMP9表达。结果 MMP9阳性区平均灰度值高CD34阳性新生血管较多。结论 脑出血后MMP9可能是促血管生成因子，强力霉素能通过调节MMP9的表达与活性影响血管生成。

　　【关键词】  脑出血；血管生成；强力霉素；MMP9；CD34

　　Effect of MMP9 in angiogenesis after cerebral hemorrhage in rats  Fang Lihong,Lou Jiyu,Bai Hongying,et al.Department of Neurology,Second Affiliated Hospital of Zhengzhou University,Zhengzhou 450014,China  【Abstract】  Objective  To study the effect of MMP9 in angiogenesis after cerebral hemorrhage.Methods  We employed the stereotactic technique to make models of the cerebral hemorrhage of mice.The level of MMP9 and the situation of CD34 masculinenewborn microvessels with immunohistochemistry  after ICH were tested. Results  During this procession, the level of MMP9 was higher, the number of CD34 masculinevessels was larger. Conclusion  MMP9 maybe the factor to promote the angiogenesis after cerebral hemorrhage and doxycycling can affect the angiogenesis by adjusting the expression and activity of MMP9.    　　【Key words】  Cerebral hemorrhage；Angiogenesis；Doxycycline；CD34；MMP9        　　MMP9（matrix metalloproteinase9,MMP9）是作用于血管内皮细胞基质的主要成分Ⅳ型胶原蛋白酶，以往研究认为它是血管损伤因子参与脑水肿的发生发展，但体外研究发现MMP9与血管平滑肌的增值、迁移有关［12］；此外，最新研究发现MMP9表达上调可促进乳腺癌新生血管的形成［3］。本研究尝试用广谱基质蛋白酶抑制剂强力霉素干预，观察不同时间点MMP9表达及CD34阳性新生微血管，探讨MMP9在大鼠脑出血后血管生成中的作用。

　　1  材料和方法

　　1.1  材料  （1）实验动物：雌性SD大鼠48只由郑州大学动物中心提供，体质量（340±30）g。（2）药品：盐酸多西环素（强力霉素）片购自江苏联环药业股份有限公司，生产批号H32021266。（3）试剂：鼠单克隆抗体试剂盒CD34、 MMP9购于北京中杉生物工程公司，其他试剂。（4）仪器：立体定位仪，100μl微量进样器，温箱，显微镜，微波炉。

　　1.2  方法  48只大鼠分随机分3组：对照组和模型组各18只分3d、7d、12d 3个时间点；干预组12只分7d、12d 2个时间点。参照 Rosenberg等［4］方法，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉（35mg/100g动物体质量）后固定在立体定位仪上，备皮消毒后暴露颅骨在前囟向前0.2mm矢状缝向左旁开3mm，用牙科钻钻开颅骨不伤及硬脑膜，再用100μl微量进样器抽取80μl的自体未凝动脉血（对照组注入等量生理盐水），从已钻孔垂直进针6mm（相当于尾状核）缓慢注入后保留10min拔出，缝合切口；模型造成后用Longa评分达到1分入选；生理盐水（剂量1.2ml/100g动物体质量）灌胃1次/d；干预组第5天改用配置好25mg/ml强力霉素悬浊液。到预定时间时处死取脑组织用10%甲醛固定。

　　1.3  标本处理及免疫组化染色  标本固定24h后，取针眼为中心厚1cm的冠状切片，石蜡色埋，在切片机上连续切片，片厚3mm，做CD34、MMP9免疫组化染色，具体步骤根据试剂盒说明书操作。

　　1.4  结果判定  每张切片先用低倍镜确定新生微血管密集区域，再计数随机5个高倍视野（400×）下CD34阳性血管总数取平均值作为该切片新生微血管计数［5］；取不同5个区域MMP9阳性区平均灰度值均值作为该切片MMP9值。

　　1.5  统计学方法  用SPSS 10.0 统计软件分析，数据用±s表示,组间比较用t检验,组内比较用单因素方差分析，两两比较用最小显著差法（LSD）检验。α=0.05为检验水准。

　　2  结果

　　2.1  CD34免疫组化染色  各组间的比较差别有统计学意义（P<0.05）。3d CD34阳性新生血管计数最多且模型组比对照组明显多，后逐渐减少，对照组12d时消失；干预组7d时比模型组略少，12d时显著减少。见表1。

　　表1  各组CD34阳性的新生血管数均值（略）

　　注：同一时间点与模型组比较，*P<0.05；同组间7d与3d比较，▼P<0.05；7d与12d比较，▽P<0.05

　　2.2  MMP9免疫组化染色  各组间的比较差别有统计学意义（P<0.05）。模型组3d时值最大，7d时维持高水平，12d时仍然有效表达。较对照组值跟模型组比3d时明显小，并迅速减少，12d时只有较少量表达；干预组7d时比模型组有所减少，12d时显著减少。见表2。

　　表2  各组MMP9阳性区平均灰度值均值（略）

　　注：同一时间点与模型组比较，*P<0.05，同组间7d与3d比较，▼P<0.05；7d与12d比较，▽P<0.05

　　3  讨论    　　血管生成是残存的血管内皮细胞增殖和迁移的过程：由血管内皮细胞和外膜细胞激活与分离 ,细胞外基质的降解;内皮细胞发芽,移行和增生并重新组合连接形成新的血管腔（在两相邻的内皮细胞未完全发育形成紧密连接时, 表达CD34紧密连接形成成为CD34阴度血管［6］）外膜细胞沿着新生血管外移行,新生血管形成［7］。在血管生成过程中内皮细胞的增殖和外周细胞外基质的降解同时进行［7］，细胞外基质含有丰富的胶原蛋白,溶解胶原是一个非常重要的过程［8］； MMP9主要作用于血管细胞外基质层(extracellular matrix，ECM)的主要成分Ⅳ胶原［9］，脑出血后MMP9大量表达及活性增强，因此MMP9可能在血管生成中具有重要作用。    　　本研究采用立体定向技术向大鼠尾状核注入自体未凝血模拟自然脑出血，选用不同时间点用免疫组化法测MMP9及CD34阳性新生微血管， 各组间比较差别有统计学意义（P<0.05），这说明脑出血除了占位性效应外，血液成分能有效刺激MMP9的表达及CD34阳性血管生成，强力霉素对其表达有明显影响。3d时MMP9灰度值最高CD34阳性新生微血管也最多，随着时间推移，MMP9表达及活性下降，CD34阳性新生微血管数也随之减少；对照组由于生理盐水较快吸收，缺少有效刺激，MMP9表达及活性迅速下降，12d时只有少量的MMP9表达此时CD34阳性新生微血管基本消失。而正常情况下，MMP9与金属蛋白酶抑制剂1(tissue inhibitor of metalloproteinase1, TIMP1)以复合物形式存在，使 ECM保持在一种动态平衡中［10］，脑出血后由于MMP9过度表达，破坏这个平衡，在机体自我调节下TIMP1、Ⅳ型胶原 (Collagen Ⅳ，COLⅣ)随之大量表达；研究发现MMP9在出血后48h达到高峰5～7d后逐渐下降，2周仍然有效表达，因此我们推测第5天时可能建立新的COLⅣ、MMP9、TIMP1之间平衡。干预组第5天使用强力霉素，抑制MMP9表达与活性，重新破坏平衡，使COLⅣ大量沉积，不利血管平滑肌移行及内皮细胞增生，结果MMP9表达迅速下降，CD34阳性微血管数也随之减少，支持此推论。    　　MMP9可能是一种促血管生成因子，脑出血后，在缺氧及血管壁损伤等因素作用下，MMP9表达及活性明显增强，促使大量血管新生。新生血管壁薄，功能不全，通透性大，这与以往研究脑出血早期MMP9表达和脑水肿存在相关性［11］相符合，3d后新生血管逐渐成熟，水肿随之减轻；因此控制MMP9表达与活性使适量血管形成及促进新生血管成熟具有重要意义。强力霉素是广谱金属蛋白酶抑制剂，可能通过蟄合MMPs的二价阳离子Zn2+抑制MMPs活性。在第5天干预能有效抑制MMP9表达与活性，减少血管形成，减少COLⅣ降解促进血管成熟，从而减轻血管的通透性；另外，强力霉素可通过抑制白细胞黏附、浸润抑制炎症反应，减轻脑组织损伤，因此它可能是脑血管病潜在治疗药物。

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