氧化应激下大鼠肝星状细胞增殖情况及硫化氢含量的变化

　　作者：刘懿芷 邓勇 秦伟 董 晋1 王 聪1 谭大勇1 樊海宁 作者单位：.青海大学医学院;2.青海大学附属医院普外二科)

　　【摘要】 目的 了解氧化应激(Oxidative stress)下肝星状细胞(Hepaticstellate cell,HSC)的增殖情况以及细胞中硫化氢(Hydrogen sulphide,H2S)含量的变化，初步探讨H2S在肝纤维化(Hepatic fibrosis)中的作用。方法 利用铁超载体外培养细胞的氧化应激模型，给予不同浓度的外源性H2S供体NaHS和KATP通道阻断剂格列本脲(glibenclamide,GLBN)，用MTT检测各组细胞的生长曲线;用敏感硫电极检测各组细胞上清液中H2S含量的变化。结果 给予FeNTA后HSC增殖，其OD值随着 NaHS浓度的增加和时间的延长而下调;给予GLBN后细胞增殖情况与前者相反;细胞增殖下调时细胞上清液和裂解液中的H2S含量升高，细胞增殖上调时H2S含量降低。结论 H2S在氧化应激下能抑制HSC增殖，具有细胞保护作用。

　　【关键词】 肝星状细胞 硫化氢 氧化应激

　　THE CHANGE OF THE PROLIFERATION OF RAT HSC ANDTHE CONCENTRATION OF H2S UNDER OXIDATIVE STRESSLiu Yizhi1， Deng Yong2， QingWei2， Dong Jin1，Wang Cong1， Tan Dayong1， Fan Haining2△(1. Medical College of Qinghai University 2. The second department of General Surgery of the affiliated hospital of Qinghai University)Abstract Objective To clarify the change of proliferation and H2S-concentration of HSC under oxidative stress, in order to explore the effect of H2S on hepatic fibrosis. Methods At first a oxidative stress model was established by incubating rat hepatic stellate cells with ferricnitri-lotriacetic acid(Fe-NTa), to supply sodium hydrosulfide(NaHS，H2S donor) and GLBN(a inhibitor of KATP channel through which H2S reacts).The HSC growth curve were detected by MTT, the content of H2S in culture supernatant and cell lysis solution were detected by sensitive sulf-electrode assy. Results The proliferation of hepatic stellate cells with FeNTA interference were increased. The OD was decreased, this trends was accordant with that to add the content of NaHS and to lengthen action time, but it was completely different after GLBN given. It was increased that the content of H2S in culture supernatant and cell lysis solution when the proliferation of HSC was increased, vice versa. Conclusion H2S may inhibit the proliferation of HSC and possess cell protecting effects under oxidative stress.

　　Key words Hepaticstellate cell Hydrogen sulphide Oxidative stress

　　肝纤维化(Hepatic fibrosis)的主要病理改变是ECM成分的过度合成与异常沉积，肝星状细胞(HSC)的活化、增殖是肝纤维化的重要环节之一。[1] HSC在正常状态下要贮存和代谢维生素A脂滴，肝脏受损时，HSC在多种因素下被激活，转化为肌成纤维细胞(myofibroblast, MFB)表达多种细胞因子和受体，进一步增殖，合成并分泌大量ECM，并表达α-平滑肌肌动蛋白(alphasmoothmuseleactin, α-SMA)，后者具有收缩功能[2]。目前第三气体信号分子硫化氢(Hydrogen sulphide,H2S)对血管的舒张血作用及调节神经功能的作用[3～6]得到了广泛的研究，其在消化系统[7～9]的作用亦受到日益重视。在哺乳动物细胞中H2S的产生途径主要有两种，其是以L-半胱氨酸为底物，在两种吡哆醛5’-磷酸依赖酶即胱硫醚-β-合酶(cystathionineβ-synthase, CBS)或(和)胱硫醚-γ-裂解酶[10](cystathionineγ-lyase ,CSE)的作用下生成，而HSC表达CSE但不表达CBS。肝硬化大鼠HSC的CSE表达明显低于对照组的表达。因此研究氧化应激下HSC的增殖情况以及H2S含量的变化对探讨肝纤维化的发生发展具有重要意义。

　　1 材料与方法

　　1.1 试剂

　　HSC-T6(湖南湘雅细胞基因库)，甲氮甲唑蓝(西安舟鼎国试剂公司)，DNEM培养基(Gibco公司)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所)，柠檬酸铁胺试剂(天津光复精细化工研究所)，次氮基三乙酸二钠(sigma分装)，NaOH、EDTA、Na2S·9H2O(均购于红岩试剂厂)，酶标仪(芬兰雷勃公司)，PXS-270离子计(上海雷磁仪器厂)。

　　1.2 细胞培养

　　HSC-6培养于含12%胎牛血清的DMEMD培养基中，于37℃、5%CO2条件下培养，选取对数生长期细胞进行实验。

　　1.3 实验分组

　　实验分组分为4组：空白组(B组，HSC-T6);对照组：(C组，HSC-T6+500μmol/L FeNTA);NaHS组(N组， N1：HSC-T6+20μmol/L NaHS; N2：HSC-T6+100μmol/L NaHS; N3：HSC-T6+200μmol/L NaHS);格列本脲组(G组，G1：HSC-T6+500μmol/L FeNTA +20μmol/L GLBN;G2 ：HSC-T6+500μmol/L FeNTA +200μmol/L GLBN;G3：HSC-T6+500μmol/L FeNTA +700μmol/L GLBN)。

　　1.4 细胞增殖的MTT法检测

　　取对数生长期HSC-T6，以每孔10000个细胞接种于96孔板，在37℃、5% CO2条件下培养过夜后，按实验组设计加入药物，分别在37℃、5% CO2条件下孵育6、12、24 h后加入MTT(终浓度0.5 mg/mL，100μL/孔)，作用4 h后弃上清加入DMSO(150μL/孔)，待结晶物充分溶解后在酶联免疫检测仪(570 nm波长)测定每孔的OD值。

　　1.5 H2S浓度的测定

　　细胞H2S含量采用敏感硫电极法进行测定。H2S通常以气体(1/3)和NaHS(2/3)两种形式存在，加入抗氧化液后，H2S、NaHS与抗氧化液中的NaOH反应生成S2-，通过敏感硫电极测定血浆中的S2-，可间接反映H2S的浓度。取对数生长期HSC-6细胞(浓度5×107/L)，于24孔培养板中每孔接种2 ml细胞悬液，37℃、5% CO2条件下孵育48 h后换用无血清培养基继续培养24 h，使细胞同步化。按照实验分组加入药物分别作用6、12、24 h后取各组细胞清液及细胞裂解液测定H2S浓度。

　　1.5.1 培养液上清液的收集

　　将细胞培养液收集到离心管中，离心(4℃ ，12000 rpm)5min，吸取上清液转移至新的离心管。

　　1.5.2 裂解液上清液的收集

　　每孔加入PBS液(1ml，4℃)后用细胞刮刮下细胞收集到离心管中，离心(4℃，12000rpm)10min，弃上清液，向离心管中加入PBS液(1ml，4℃)再次洗涤细胞，在上述离心条件下再次离心后弃上清液，加入PBS(1ml，4℃)悬浮细胞，-20℃放置20 min，37℃恒温水浴10 min，重复两遍，破碎细胞膜，加入1 ml PBS后离心(4℃，12000rpm)15min，取上清液备用。具体测定步骤见耿彬法[11]。

　　1.6 统计学处理方法

　　采用SPSS11.5软件进行分析，结果以x±S表示，显著性检验用单因素方差分析(one-way ANOVA)，做6、12、24 h上清液H2S浓度与细胞OD值的Pearson相关分析，检验水准取α=0.05。

　　2 结果

　　2.1 MTT法检测细胞增殖结果(表1)

　　6 h和12 h的空白组无明显差异，两者与24 h组皆存在明显差异(P<0.05)。在给予药物处理的三个时间点对照组与空白组中的OD值相比存在明显差异(P<0.05);在6 h G3组的OD值与对照组相比存在明显差异(P<0.05);在12 h N2组、G3组的OD值与对照组相比存在明显差异(P<0.05);在24h N1、N2、N3、G1、G2组的OD值与对照组相比存在明显差异(P<0.05)。实验细胞每孔密度为5×107/L，每组设6个复孔即n=6，见表1。表1不同处理因素对HSC-T6增殖的影响

　　2.2 培养上清液、裂解液H2S测定结果

　　2.2.1 培养上清液中H2S浓度(表2)

　　对照组各时间段H2S浓度下降，随着时间延长对照组与空白组有明显差异(P<0.05);给予H2S的外源性供体NaHS后，除6 h N1组外其余各组与对照组存在明显差异(P<0.05)，H2S浓度随着药物浓度的提高和作用时间的延长逐步提高;给予KATP通道阻滞剂GLBN后除6 h的G1、G2组外其余各组与对照组存在明显差异(P<0.05)，H2S浓度随着药物浓度的提高和作用时间的延长逐步降低(实验细胞每孔密度为5×107/L，每组设3个复孔即n=3)，见表2。表2上清液中H2S浓度注：﹡与同时期B组比较P<0.05，﹟与同时期C组比较P<0.05.

　　2.2.2 裂解液中H2S浓度

　　对照组各时间段H2S浓度下降，随着时间延长对照组与空白组比较存在明显差异(P<0.05);给予H2S的外源性供体NaHS后，除6 h N1、N2组外其余各组与对照组存在明显差异(P<0.05)，H2S浓度随着药物浓度的提高和作用时间的延长逐步提高。给予GLBN后6 h的G2、G3组、12 h的G3组，24 h的G2、G3组与对照组存在明显差异(P<0.05)，H2S浓度随着药物浓度的提高和作用时间的延长逐步降低，其余各组与对照组比较差异不明显。(实验细胞每孔密度为5×107/L，每组设3个复孔即n=3)表3裂解液中H2S浓度注：﹡与同时期B组比较P<0.05，﹟与同时期C组比较P<0.05.

　　2.3 H2S与细胞增殖的关系

　　经Pearson相关分析显示，12、24 h组培养液上清液中H2S浓度与同时间段的细胞OD值的相关系数是-0.872、-0.87(P<0.05)，三个时间段的裂解液上清液中的H2S浓度与同时间段的细胞OD值的相关系数是-0.853、-0.869、-0.908(P<0.01)，呈高度负相关。

　　3 讨论

　　HSC在正常情况下处于静止状态，当肝脏受到炎症或者机械刺激等损伤时，邻近的细胞如肝细胞、Kuffer细胞、窦内皮细胞和血小板等通过旁分泌作用可分泌多种细胞因子,如TNF-α、TNF-β、PDGF、ET-1等，促使HSC出现肌成纤维样母细胞(myofibrolast，MFB)样表型转化，激活并导致细胞增殖、ECM合成增加等，而ECM的过度合成和沉积是是肝纤维化的主要病理改变。

　　内源性H2S被认为是血管舒张因子，有实验发现，给大鼠注射去甲肾上腺素(NE)发现门静脉压呈剂量依赖性增高，但这种效应在经NaHS治疗过的老鼠身上被部分消除，提示H2S在调节门静脉压方面有重要作用[12];H2S对肝微循环舒张功能的调节，可以被格列苯脲减弱，说明H2S通过KATP通道途径使血管舒张[13];胆管结扎能下调CSE mRNA的表达和活性，在肝内CSE表达的降低可以导致肝内阻力增加和门静脉压力过高[14]。

　　H2S的合成酶CSE在肺动脉、主动脉、尾动脉、肠系膜动脉以及门静脉等血管壁组织中都有表达，能产生H2S以舒张血管平滑肌，降低体动脉压[15]。H2S与NO对血管平滑肌的舒张效应具有协同效应[8]。H2S诱导的血管舒张可能与以下机制有关：①通过KATP通道途径使容量血管平滑肌舒张[15];②由KATP通道和EDHF共同参与对阻力血管的舒张作用[14];③通过减少细胞外Ca2+内流而产生舒血管效应[15]。有研究证实[16]H2S可抑制平滑肌细胞增殖，可以在分子水平直接调节血管平滑肌张力，降低血压。H2S可以使应用乙酰胆碱后处于收缩状态的回肠产生剂量依赖性的舒张效应，减弱乙酰胆碱介导的回肠收缩，并可降低回肠对电刺激壁内神经丛的反应性，表明内源性H2S可调节消化道平滑肌的收缩功能[1,17]。

　　通过我们目前已经进行的一系列研究表明：在肝硬化患者血清中H2S的浓度较正常人降低[18];在大鼠肝缺血-再灌模型和结扎大鼠肝动脉模型中，血清H2S的浓度都较正常对照组升高，用NaHS干预后，肝细胞变性明显延缓[19];梗阻性黄疸患者血清中的H2S含量低于正常人并与血清直接胆红素(direct bilirubin，DBIL)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)成高度正相关，解除梗阻因素后H2S含量高于正常人但低于治疗前;在大鼠梗阻性黄疸模型中也有同样的发现。现阶段我们可以认为，H2S可能是肝硬化发病机制中的一个重要的调节因子。

　　通过本实验可以发现，给予FeNTA后HSC发生增殖，其增殖随着给予 NaHS浓度的增加和作用时间的延长而下调，在给予GLBN后细胞增殖随浓度增加和时间延长而上调;用敏感硫电极检测不同时间段时正常生长下、氧化应激下、给予NaHS干预和给予KATP通道阻滞剂GLBN下等四种情况下的细胞上清和裂解液中的H2S含量基本上与同时间段同一条件下的细胞OD值成高度负相关(除6h时的细胞上清液的H2S含量和同期的细胞OD值外)。这种情况可能归结于在氧化应激下HSC增殖，而在HSC时CSE表达减少，因此作为合成内源性H2S的主要酶的表达减少必然导致H2S含量的降低。在给予H2S的外源性供体NaHS后下调了细胞增殖程度，从而提高了细胞中的H2S含量;反之，给予GLBN后细胞增殖情况以及细胞中的H2S含量的变化说明HSC增殖的调控可能是通过KATP通道进行的。

　　本实验说明H2S可在某种程度上抑制HSC的增殖，对HSC具有一定的保护作用;HSC的增殖可能是通过对KATP通道的调节进行的。

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