DNA修复酶在胃癌组织中的表达变化及临床意义

　　作者：吴迎爽 周 宁 程 毅 魏贵亮 谢 震 祁 贺 薄爱华 张晓丽 邢立强 作者单位：河北北方学院大学生科协，河北 张家口 075000

　　【摘要】 目的：检测胃癌组织中DNA损伤修复酶(O6—甲基鸟嘌呤—DNA甲基转移酶O6—methylguanine DNA methyltransferase, MGMT)的表达变化，探讨其表达和胃癌临床病理特征之间的关系,进一步用于指导临床化疗方案的制定。方法：采用免疫组化方法(SABC法)检测55例胃癌标本中MGMT的表达情况。结果：MGMT在胃癌组织中的阳性表达率为43.64%(24/55)，其阳性表达与年龄、病理类型有关，而与性别`、分化程度、侵犯深度、淋巴结转移的相关性不明显。结论：MGMT对胃癌化学治疗方案的制定有指导作用。

　　【关键词】 胃癌;DNA损伤修复酶;免疫组化

　　Study on the Expression of DNA Repairing Enzyme in

　　the Gastric Carcinoma and Its Clinical Significance

　　WU Yingshuang,ZHOU Ning,CHEN Yi, et al

　　Hebei North University,Zhangjiakou, 075000，Hebei China

　　【ABSTRACT】 Objective: To investigate the expression change of DNA repairing enzyme MGMT in gastric carcinoma,and the relationship between the expression and pathologic charateristic,so as to guide makingup of treating plan. Methods: Detect the expression of 55 cases with gastric carcinoma by SABC immunohistochemistry. Results:The positive expression rate of MGMT in the gastric carcinoma was 43.64%(24/55).There was a signficant statistic difference between age and pathologic type in the expression of MGMT, but no obvious correlation among sex, defferentiation degree,invasion depth and lymphnode metastasis.Conclusion:The expression of MGMT can guide to make up a plan for treating gastric carcinoma.

　　【KEY WORD】 Gastri carcinoma; DNA repairing enzyme(MGMT); Immunohistochemistry

　　烷化剂与DNA相互作用可以在DNA分子中形成各种烷化碱基，其中O6—甲基鸟嘌呤与基因突变和癌症发生关系最为密切。生物体内含有一种高度专一性DNA修复酶即O6—甲基鸟嘌呤—DNA甲基转移酶(O6—methylguanineDNA methyltransferase MGMT)，该酶能够有效地修复DNA分子中O6位鸟嘌呤的烷化碱基,在防止烷化剂诱导的致癌、致突变和抗癌化疗过程中均起重要作用[1]，从而有效维持着基因组的稳定。本文主要讨论DNA损伤修复酶MGMT在胃癌中的表达变化及其与胃癌临床病理特征之间的关系,进一步用于指导胃癌化学治疗方案的制定。

　　1 资料和方法

　　1.1 标本来源 收集河北北方学院附属第一医院肿瘤外科2002.3～2005.4月间胃癌根治术切除的55例标本。其中女性患者17例,男性患者38例;年龄在29～79岁之间,平均年龄为53.87岁;高分化腺癌28例,中分化腺癌6例,低分化腺癌12例;粘液腺癌9例。所有患者术前均未经化疗和放疗。

　　1.2 试剂 兔抗人MGMT多克隆抗体购自武汉博士德生物有限公司,SABC免疫组化试剂盒及DAB显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技有限公司。

　　1.3 方法 (1)术后立即取材,以4%多聚甲醛0.1MPSB(pH=7.2内含0.1%DEPS)固定约3h,常规脱水，浸蜡，包埋,连续切片,厚度约5μm;(2)将切片贴于涂有多聚赖氨酸的载玻片上,常规脱蜡至水;(3)抗原热修复：将切片浸入0.01M枸橼酸盐缓冲液，微波炉加热至沸腾，间隔5～10min,反复1～2次;(4)滴加5%BSA封闭液,室温20min;(5)滴加一抗(兔抗人IgG),4℃过夜;(6)0.01mol/L PBS冲洗2min×3次;(7)滴加生物素化山羊抗小鼠IgG,20℃～37℃,20min;(8)0.01mol/L PBS冲洗2min×3次;(9)滴加试剂SABC,20℃～37℃,20min;(10)0.01mol/L PBS冲洗5min×4次;(11)DAB显色;(12)脱水,透明,封片。

　　阴性对照，以PBS代替一抗，其余步骤相同;阳性对照片为已知人胃癌阳性组织切片。

　　1.4 结果判定 光镜下观察MGMT阳性物质分布在胞浆中,呈棕黄色。每张切片中阳性细胞数>5%为阳性病例,阳性细胞数<5%为阴性病例。

　　1.5 统计学处理 组间比较采用χ2检验。

　　2 结果

　　55例胃癌中，MGMT阳性表达为24例，阳性率为43.64%，其阳性表达与年龄、病理类型有关,与性别、分化程度、侵犯深度、淋巴结的转移的相关性不明显(详见表1)。表1 MGMT表达与性别、年龄、病理类型、侵犯深度、淋巴结的转移临床病理特征的关系(55例)注: MGMT在年龄中阳性表达比较 * P<0.05;MGMT在管状型腺癌和黏液型腺癌中阳性表达比较 ▲ P<0.05。

　　3 讨论

　　人类DNA在自身及环境中受各种有害因素的作用不断的发生损伤，同时又通过各种各样修复系统修复DNA损伤维持机体的稳定。烷化剂是一类重要的诱变剂及致癌物质，其分子中的一个或多个烷基(主要是甲基或乙基)，可转移到DNA分子碱基上，形成烷基加合物。其中O6—甲基鸟嘌呤是亚硝氨等烷化剂和DNA碱基形成的并与致癌作用有关的一种主要加合物。人MGMT基因定位染色体10q26上,全长约170kb,被I-kilohase mRNA编码，其抵抗细胞毒的作用主要取决于肽链145位上的半胱氨酸位点，含5个外显电子，其中第一个外显电子不翻译，而是参与基因的表达调控[2]。其作用原理是：MGMT可将鸟嘌呤O6位的甲基转移到自身的半胱氨残基上，在体蛋白分子中形成O6—甲基转移酶，DNA分子甲基鸟嘌呤则脱去甲基，整个甲基转移过程无其他蛋白参与，也就是说同一蛋白既作为甲基转移酶又作为甲基受体蛋白[3]。这种“自杀”式的反应机制使得机体烷基加合物的修复能力取决于MGMT在细胞内的含量及其合成速度。因此MGMT在保护细胞免受烷基类物质的毒性、抑制基因突变性和致癌活性方面均具有决定性作用。

　　总之,MGMT是一种重要的DNA修复蛋白,其基因组结构及表达异常与肿瘤的发生有关。事实上有人已将这种编码DNA修复蛋白的基因称为潜在癌基因或抗癌基因。最近研究表明，MGMT蛋白表达的缺失或突变与许多恶性肿瘤有关，包括胰腺癌、结肠癌、神经角质瘤、睾丸的非精原细胞癌等[4]。本实验表明，胃癌中MGMT的阳性表达低于阴性表达，提示MGMT阳性表达缺失与胃癌的发生有关，由此可推测组织中MGMT异常，不能发挥正常的作用或作用不足时该加合物与胸腺嘧啶错配，发生G—C→A—T突变，导致癌基因激活，进一步促使组织细胞向恶性肿瘤转变。从这个角度考虑,检测MGMT阳性表达高低对肿瘤的预见有重要的临床指导意义。同时本文研究表明不同年龄段阳性表达高低不同,从而在临床上对不同年龄段病人可以采取不同的治疗方案。例如本组资料中年龄在45～60岁之间的患者阳性表达较高,需要采取烷化剂抗癌物质进行化学治疗方法。

　　耐药是恶性肿瘤化疗成功的主要障碍,如何预见和克服肿瘤细胞对化疗药物的耐药性是肿瘤化疗急需解决的问题。MGMT在防止烷化剂诱导的致癌、致突变和抗癌过程中以及肿瘤对烷化类抗癌药物的耐药方面发挥着双重作用[5]。有研究表明MGMT酶活性低的细胞(Mer-)对烷化类抗癌药物敏感，而酶活性高的细胞(Mer+)则对烷化类抗癌药物有抗性[6]，因此MGMT酶活性可以作为评价胃癌预后的一个生物学指标。本组资料研究表明MGMT在胃癌组织中管状腺癌表达活性低于黏液型腺癌,即提示管状腺癌对烷化类抗癌药物敏感。有研究表明野生型P53能抑制肿瘤细胞MGMT表达及活性,提高肿瘤细胞对烷化类抗癌药物的敏感性[7]。抑制MGMT酶活性可以在基因治疗中起到增强化疗药疗效果的作用。因此检测胃癌组织中MGMT表达状况将对临床化疗药物的选择有重要意义。

　　【参考文献】

　　1 董红梅,沈忠英.DNA修复酶MGMT与肿瘤关系的研究进展[J].癌变畸变突变，1999，21(3)：129131

　　2 梁刚.MGMT在原发性肝癌中的表达及其临床意义[J].中国现代医学杂志，2005，15(4)：10091011

　　3 王亮.O6—甲基鸟嘌呤—DNA甲基转移酶与肿瘤[J].国外医学肿瘤分册，1999，26(3)：129131

　　4 张天华,邹小明,刘建丰,等.MGMT蛋白在胃癌中的表达及临床意义[J].中国普通外科杂志，2005，14(3)：225226

　　5 杨军,陈建民,章扬培.O6—甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶基因表达提高肿瘤细胞的烷化抗性[J].科学通报，1996，22(1)：253

　　6 金顺钱,张伟.参与肿瘤转移的细胞表面粘连受体[J].国外医学肿瘤学分册1994，21(3)：130132

　　7 黄长军,博继梁.从DNA修复机理看细胞癌变的发生机制[J].生物化学与生物物理进展，1996，23(5)：413414