大肠癌组织中VEGF-C、VEGFR-3、LMVD与临床病理参数的关系

　　作者：李克强 李光明 曹树立 刘颖斌 胡锡浩 作者单位：315000 浙江省宁波市第二医院(李克强 李光明 曹树立 胡锡浩)　310009 浙江大学医学院附属第二医院普外科(刘颖斌)

　　【关键词】 大肠癌组织　VEGF-C　VEGFR-3　LMVD

　　淋巴道转移是大肠癌的主要转移途径，淋巴道转移时必须流经新生的淋巴管，但淋巴管生成的机制尚不清楚。本研究通过免疫组化技术检测淋巴管生成因子(VEGF-C)及其受体(VEGFR-3),通过5，-核苷酸酶(5，-Nase)组织化学技术检测淋巴管密度(LMVD)，探讨淋巴管生成因子及LMVD与临床病理参数的关系，在淋巴管生成的分子生物学及形态学方面探讨大肠癌的淋巴管生成与淋巴转移机制，为大肠癌的临床分期、预后判断及抗淋巴转移提供理论依据及技术支持。

　　1 资料与方法

　　1.1 一般资料

　　收集(同济大学附属同济医院)2001年12月至2003年10月手术切除的大肠癌新鲜标本50例，患者术前均未接受放、化疗，术后经病理检查确诊。每例大肠标本取大肠癌组织、癌旁组织、正常肠组织各一块，所有标本在肿瘤切下后1h内置于液氮中，然后置于-70℃低温冰箱保存备用。50例中男22例，女28例，年龄23～90岁(平均69.52岁);腺癌45例，黏液腺癌5例;高分化(G1)18例，中分化(G2)22例，低分化(G3)10例。同时收集50例大肠癌患者的Dukes分期、组织学类型、分化程度、淋巴结转移等病理资料。

　　1.2 免疫组织化学染色与定量分析

　　采用免疫组化SP法检测对50例大肠癌组织、正常肠组织测定VEGF-C、VEGFR-3表达情况，VEGF-C、VEGFR-3试剂盒均购自晶美生物工程有限公司(SABC方法)。一抗稀释浓度均为1：100，以已知阳性切片为阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照，免疫组化流程参照说明书进行。染色结果判断：VEGF-C、VEGFR-3表达于肿瘤细胞浆，阳性细胞胞浆呈棕褐色或棕黄色颗粒染色，以阳性细胞超过全部肿瘤细胞的10%为表达阳性。定量分析:采用Axioplan 2 imaging 显微图像分析系统(ZEISS，德国)对免疫组织化学染色进行定量分析[1]。图像分析的基本步骤：(1)图像输入:真彩色彩图,画面1300×1030 ;(2)图像增强:去除原图中各种噪声和畸变,使像质得到改善，常用阴影校正、对比度增强、灰度变换、平滑处理、锐化处理等法;(3)图像分割:根据图像的结构特征,选取灰度阈值,分离出感兴趣的对象物, 变为黑白二值图像;(4)图像二值化处理: 对二值图像进行处理，整理图像画面,保留待测对象，常用腐蚀膨胀、填空洞、擦碎片等方法;(5)图像识别及图像分析处理:选取测量参数,自动测量和分析，数据可转换到Excel进一步分析处理;(6)每张切片随机采集3幅图片进行测量，取平均值。以同样方法检测对照组标本。

　　1.3 酶组织化学染色

　　5，-核苷酸酶(5，-Nase)淋巴管染色：(1)丙酮固定5min;(2)孵育：将冰冻切片放入盛有5，-Nase孵育液容器内，37℃孵育箱孵育30min;(3)染色：蒸馏水洗切片，1%硫化亚氨显色1～2min;(4)透明、封片。

　　1.4 图片分析法定量

　　5，-Nase淋巴管染色定量分析已染色好的切片置于Axioplan 2 imaging 显微图像分析系统检测LMVD，将酶组织染色好的切片置于Axioplan 2 imaging 显微图像分析系统的图像分析仪200倍视野下，以淋巴管为测试对象，随机选择5个视野计数LMVD，5个均值为该组织的LMVD。结果判定：淋巴管呈棕色，在同一切片上较易判断，同一组织做HE染色对照观察。

　　1.5 统计学处理

　　所有数据均使用SPSS 11.5软件包进行统计处理。VEGF-C、VEGF-D和淋巴管密度与临床病理因素的关系、各组及组间比较采用χ2检验、t检验或方差检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 两组VEGF-C、VEGFR-3、LMVD比较

　　见表1。实验组VEGF-C(图1)、VEGFR-3(图2)阳性率及LMVD(图3)均高于对照组，提示大肠癌组织中淋巴管生成增加(表1)。表1 大肠癌、正常组织中VEGF-C、VEGFR–3、LMVD的表达(略)

　　2.2 实验组VEGF-C、VEGFR-3与LMVD的关系

　　实验组VEGF-C、VEGFR-3的表达与LMVD存在相关性，VEGF-C阳性组中的LMVD高于阴性组(11.86±2.42与7.82±2.69, P<0.01)，见表2; VEGFR-3阳性组中的LMVD高于阴性组(11.84±2.38与8.54±3.15, P<0.01)，见表3,说明VEGF–C、VEGFR-3 的过表达可促进淋巴管的生成。表2 VEGF-C表达与LMVD的关系(略) 表3 VEGFR-3与LMVD表达的关系(略)

　　2.3 实验组VEGF-C、VEGFR-3、LMVD与临床病理参数的关系

　　VEGF-C的表达与淋巴转移(P<0.01)、Dukes 分期(P<0.01)相关;VEGFR-3 的表达与淋巴转移(P<0.01)相关; LMVD与淋巴转移(P<0.01)、Dukes 分期(P<0.01)、分化程度(P<0.05)相关;见表4。表4 实验组VEGF-C、VEGFR-3的表达及LMVD与临床病理参数的关系(略)

　　3 讨论

　　大肠癌是最常见的消化道恶性肿瘤，淋巴道转移是大肠癌最主要的转移途径，也是大肠癌主要的死亡原因之一，若能从淋巴管生成的角度阐述其大肠癌各临床病理参数间的关系，势必对大肠癌预后的判断、抗淋巴转移的治疗有重要的指导意义。

　　VEGF-C是一种针对淋巴管内皮细胞的有丝分裂原，在分化的鸟绒毛膜尿囊中显示有选择性促进淋巴管生成的作用。为评价淋巴管生成对肿瘤转移的重要性，Skobe应用转染有遗传MDA- MB- 435绿荧光蛋白的人乳腺癌细胞的研究提示，一种自发性乳腺癌转移模型可过度表达VEGF-C，表明乳腺癌中存在淋巴管生成;并认为，VEGF-C作为肿瘤淋巴管生成的一种潜在增强因子，可促进乳腺癌的肿瘤细胞向区域淋巴结和肺转移扩散[2]。VEGF-C表达与肿瘤淋巴管生成和区域淋巴结转移的临床相关性报道亦不少，人类许多恶性肿瘤包括甲状腺癌、前列腺癌、胰腺癌[3]、乳腺癌[4]中的VEGF-C表达与区域淋巴结转移显著相关。

　　淋巴管密度(LMVD)，即单位面积中毛细淋巴管及淋巴管的数目。肿瘤周围LMVD的增加可增加肿瘤边缘淋巴管的表面积，后者使肿瘤细胞入侵机会增加，故LMVD的增加可促进肿瘤转移。对于微淋巴管密度与大肠癌各临床病理参数间的关系，Schoppmamn 用抗Podoplain及抗CD34对乳腺癌标本的微淋巴管和微血管免疫组化染色，结果显示LMVD和微淋管浸润(lymphatic vessel invasion，LVI)与淋巴转移有关，LVI、LMVD是独立的预后指标，且LMVD与肿瘤周围的炎性浸润密切相关[5]。Adachi[6]对肺癌的研究也支持Schoppmamn 的观点。但近期的一些动物试验则得出与之相反的结论[7]。

　　Padera认为，VEGF-C的过度表达增加了肿瘤内部及边缘淋巴管的表面积，肿瘤内部为无功能的淋巴管，肿瘤周边存在有功能的淋巴管，足以致肿瘤细胞发生转移[8]。胃癌中，淋巴管密度与VEGF-CmRNA水平、胃癌分化程度、淋巴结转移和淋巴浸润有关[9]。目前，在临床病理研究中明确肿瘤的LMVD与VEGF-C 、 VEGFR-3的报道较少，而在动物实验则其关系较明确。 本试验发现VEGF-C、 VEGFR-3、LMVD均与反映预后的病理特征(淋巴转移相关)显著正相关，且表达显著高于正常组织，提示LMVD与VEGF-C、VEGFR-3可作为大肠癌淋巴转移的预测因子，本实验结果和Padera的研究结果相一致。

　　VEGF-C / VEGFR-3信号传导通路的表达，可引起淋巴管数目的增加及淋巴管的扩张，从而导致LMVD的增加，这可能是肿瘤细胞淋巴转移的形态学基础及淋巴管密度的增加的机制。VEGF-C / VEGFR-3信号传导通路可能是肿瘤淋巴管生成或扩张的机制所在或者是一个主要环节，并且，增生或扩张的淋巴管为肿瘤细胞向淋巴结转移提供了途径，因此研究VEGF-C 、VEGFR-3、LMVD三者之间的关系，对明确淋巴管生成的机制具有一定的意义，可为大肠癌的预后判断及抗淋巴转移治疗提供理论和试验依据。

　　【参考文献】

　　1 Herbst RS,Yano S,Kuniyasu H,et al.Differential expression of E-cadherin and type IV collagenase genes predicts outcome in patients with stage I non-small cell lung carcinoma.Clin Cancer Res ,2000，6:790～797.

　　2 Skobe M,Hamberg LM,Hawighorst T,et al.Induction of tumor lymphangiogenesis by VEGF-C promotes breast cancer metastasis.Nature Medicine,2001，7:192～198.

　　3 Tang RF,Itakura J,Akiawa T,et al.Overexpression of lymphangiogenic growh factor VEGF-C in human pancreatic cancer .Pancreas,2001,22:285～292.

　　4 Li YS,Kaneko M,Amatyo VJ,et al. Expression of vascular endothelial growth factor-C and its receptor in invasive micropapillary carcinoma of the breast. Pathol Int, 2006，56(5):256～261.

　　5 Schoppmann SF,Birner P,Studer P,et al.Lymphatic microvessel density and lymphovascular invasion assessed by anti-podoplanin immunostaining in human breat cancer .Anticancer Res,2001,21(4A):2351～2355.

　　6 Adachi Y,Nakamura H,Kitamura Y, et al. Lymphatic vessel density in pulmonary adenocarcinoma immunohistochemically evaluated with anti-podoplanin or anti-D2-40 antibody is correlated with lymphatic invasion or lymph node metastases. Pathol Int， 2007，57(4):171～177.

　　7 Makin T,Jussila L,Veikkola T,et al.Inhibition of lymphangiogenesis with resulting lymphedema in transgenic mice expressing soluble VEGF receptor-3 .Nat Med,2001,7:199～255.

　　8 Padera TP, Kadambi A, Tomaso E, et al. Lymphatic metastasis in the absence of functional intratumor lymphatic . Science，2002，296(5574):1883～1886.

　　9 Shida A,Fujioka S,Kobayashi K, et al. Expression of vascular endothelial growth factor (VEGF)-C and -D in gastric carcinoma.Int J Clin Oncol, 2006，11(1):38～43.