P物质受体拮抗剂对急性坏死性胰腺炎时肺损伤保护作用的实验研究

　　作者：胡浩霖，石欣，霍明东，高乃荣，范健 作者单位：东南大学附属中大医院 普外科，江苏 南京 210009

　　【摘要】 目的:探讨神经激肽1受体(NK1R) 拮抗剂对急性坏死性胰腺炎(ANP)大鼠肺损伤的作用，了解ANP时阻断该受体对肺损害是否具有保护作用。方法:90只健康成年SD大鼠随机分为正常对照组、ANP组和拮抗剂组各30只。正常对照组开腹后只翻动胰腺，ANP组和拮抗剂组胆胰管恒速逆行注射5%牛磺胆酸钠，制成ANP大鼠模型。拮抗剂组在制模成功后经尾静脉注射NK1R拮抗剂spantide(0.001 25%) 0.5 ml。检测不同时间点肺髓过氧化物酶(MPO)活性和肺毛细血管通透性(LCP)的变化。应用免疫组织化学方法进行NK1R的组织学定位。结果:ANP组6h后肺组织MPO活性和LCP即明显高于正常对照组，并且持续升高(P<0.01)。与正常对照组的各个时间点相比，拮抗剂组肺组织MPO活性和LCP没有明显变化(P>0.05)。免疫组化检查显示，NK1R的表达主要位于肺泡隔血管内皮细胞表面及部分肺泡Ⅰ、Ⅱ型上皮细胞表面等处。结论:ANP 时，P物质通过与NK1R结合发挥作用，NK1R拮抗剂阻断了P物质的作用路径，对ANP肺损伤起到一定的治疗作用。

　　【关键词】 急性坏死性胰腺炎;神经激肽1受体;神经激肽1受体拮抗剂;肺损伤;大鼠

　　急性坏死性胰腺炎(ANP)是外科重危急症之一，病理演变迅速，病情险恶。ANP时最易受损的靶器官是肺，50%~70%的急性胰腺炎病人肺功能受损，部分发展为急性呼吸窘迫综合征(ARDS) [1]。因此，防治肺损伤对提高ANP疗效有着重要的意义。ANP并发肺损伤的发病机制尚未完全清楚。近来的研究表明，P物质在炎性疾病中起到重要的作用[23]。 P物质与3种G蛋白偶联的神经激肽受体结合，分别为神经激肽1受体(NK1R)、神经激肽2受体(NK2R)和神经激肽3受体(NK3R)。我们以往的研究表明，ANP时肺组织中NK1R的表达水平明显上调，扰乱了神经激肽的作用环节，加剧了ANP 时的肺损害[4]。本研究通过制作ANP模型，予NK1R拮抗剂干预，探讨NK1R拮抗剂在ANP肺损伤发病机制中的作用，为ANP肺损伤的防治提供一条可能的途径。

　　1 材料和方法

　　1.1 ANP模型制作健康成年SD大鼠90只，体重250～280 g。实验前大鼠禁食12～16h，不禁水。2%戊巴比妥钠0.01 ml·kg-1腹腔注射麻醉。60只大鼠采用胆胰管内逆行注射5%牛磺胆酸钠(0.1 ml·kg-1)建立ANP模型。正常对照组(30只)仅将十二指肠提出切口，轻轻翻动胰腺3次，不注射牛磺胆酸钠，余操作步骤与下述ANP组相同。将已成功制备的ANP模型大鼠随机分为以下两组：(1)ANP组(30只)，制模成功后经尾静脉注射09%生理盐水0.5 ml;(2)拮抗剂组(30只)，制模成功后经尾静脉注射NK1R拮抗剂0.001 25% spantide (Sigma 公司) 0.5 ml。分别于6、12和24h处死大鼠(各10只)，留取部分肺脏、胰腺和门静脉血标本，立即切成块状并投入液氮，保存于-80℃超低温冰箱中，或经福尔马林固定后脱水包埋、常规切片。

　　1.2 淀粉酶和肺髓过氧化物酶(MPO)活性的测定血液分离血浆后进行淀粉酶检查(碘淀粉比色法)。肺组织匀浆后超声粉碎成亚细胞成分，肺组织MPO活性测定按照MPO检测试剂盒(Sigma公司)进行。

　　1.3 肺毛细血管通透性(LCP)的测定采用伊文思蓝浸入法测定各组大鼠的LCP。经尾静脉穿刺注入2%伊文思蓝(1 ml·kg-1)，15 min后处死动物，剖胸后由右心室匀速注入10 ml生理盐水冲洗血管内染料，取出肺脏，将肺表面水分吸尽后，于电子天平上称取湿重，放入4 ml甲酰胺中，于37℃温箱放置24h，提取组织中染料。过滤后染液用分光光度计于620 nm处读取OD值，通过标准曲线计算提取出的染料量，以单位组织中染料提取量反映LCP。伊文思蓝标准曲线的建立方法：分别取0.1%伊文思蓝标准品0、5、15、20、30、40μl，加入4 ml甲酰胺中，620 nm比色，将数据进行回归分析，得到回归方程：OD=0.011x-0.001，r=0.99。

　　1.4 免疫组织化学检测分析石蜡切片经过脱蜡至水后，浸泡在TBS缓冲液(10 mmol·L-1 TrisHCl,0.85% NaCl，0.1% TritonX100，pH 7.4)中15 min，用稀释度1∶200的羊抗大鼠NK1R多克隆抗体(Santa Cruz公司)于4℃湿盒内孵育过夜，二抗为兔抗羊IgG(美国Kirdegarrd & Perry Laboratories 公司)，室温下孵育30 min，TBS振洗3遍后加链霉亲合素过氧化物酶复合物，室温下孵育30 min，滴入新鲜配制的显色溶液(美国Kirdegarrd & Perry Laboratories 公司)，然后苏木精衬染细胞核，逐步脱水，二甲苯透明，最后用中性树脂封片。

　　1.5 统计学处理实验结果以x-±s表示，用Prism软件包(美国圣地亚哥GraphPad软件公司)进行统计学分析。组间差异用MannWhitney U检验或精确卡方检验，P<0.05为差异有显著意义。

　　2 结果

　　2.1 淀粉酶检查和胰腺病理学检查与正常对照组相比，ANP组血淀粉酶显著升高。开腹证实腹腔内有血性腹水，可见胰腺出血斑和坏死灶。镜下病理检查也证实ANP的发生，还可见肺泡壁塌陷，间质毛细血管扩张、充血，肺泡隔中性粒细胞浸润明显，部分中性粒细胞游走到肺泡腔内。

　　2.2 各组大鼠肺组织MPO活性的变化见表1。ANP组6h后肺组织MPO活性即明显高于正常对照组，并且持续升高，在24h时达到(7.91±0.48)U·g-1(P<0.01)。与正常对照组的各个时间点相比，拮抗剂组肺组织MPO活性没有明显变化(P>0.05)。

　　2.3 各组大鼠LCP的变化见表2。ANP组6、12、24h时LCP值均明显高于正常对照组(P<0.01);与正常对照组的各个时间点相比，拮抗剂组LCP值没有明显变化(P>0.05)。

　　表1 各组大鼠肺组织MPO活性的变化(略)

　　Tab 1 MPO levels in the lungs of each groups

　　1)与正常对照组相应时间点比较，P<0.01; 2)与正常对照组相应时间点比较，P>0.05

　　表2 各组大鼠LCP变化(略)

　　Tab 2 LCP levels in each groups

　　1)与正常对照组相应时间点比较，P<0.01; 2)与正常对照组相应时间点比较，P>0.05

　　2.4 NK1R的组织学定位正常对照组中，6h后部分肺泡隔血管内皮细胞表面有淡黄色颗粒，少数肺泡上皮细胞也有轻度染色，到12、24h后该受体仍只有轻度表达。与之相比，ANP大鼠在6h后多数肺泡隔血管内皮细胞表面出现广泛棕黄色颗粒，部分肺泡Ⅰ、Ⅱ型上皮细胞表面也可见黄褐色颗粒，12、24h上述细胞仍保持高表达 (图1)。

　　3 讨论

　　P物质是一种神经激肽，来源于前速激肽原(PPT)A基因编码的3种PPT，即αPPT、βPPT和γPPT。P物质具有多种生物活性，是神经源性炎症中的重要介质，在免疫系统中亦起着重要的调节作用。近年来的研究发现，P物质不仅可以引起胰腺血浆渗出，造成胰腺损伤，而且在ANP急性肺损伤中也发挥着重要作用。McDonald等[5]在研究大鼠气管的实验中发现，P物质通过与血管内皮细胞G蛋白偶联的NK1R结合，引起毛细静脉内皮细胞间隙的形成，蛋白和液体渗出，形成炎性水肿。Bhatia等[6]研究了P物质及其受体NK1R在急性胰腺炎肺损伤中作用，发现NK1R基因缺失的急性胰腺炎小鼠肺组织内聚集的中性粒细胞减少，肺微血管通透性降低。

　　胞浆中棕黄色颗粒为阳性着色

　　图1 NK1R在正常对照组(A)和ANP组(B)肺组织中的表达 免疫组织化学染色×200(略)

　　Fig 1 The expression of NK1R in the lungs of normal control (A) and ANP (B) rats(Immunohistochemistry staining×200)

　　我们以往的研究已证实，ANP大鼠肺组织中NK1R mRNA和蛋白水平都过度表达，扰乱了神经激肽的作用环节，加剧ANP 时的肺损害[4]。近年来，国外的研究也提示NK1R的变化对ANP病情起到重要的作用。Grady等[7]发现，对NK1R(+/+)小鼠注射P物质，胰腺血浆的渗出增加2倍，而对于NK1R(-/-)小鼠，P物质则不起作用，NK1R的拮抗剂CP-96345可以阻断P物质所引起的血浆渗出。Maa等[8]在坏死性胰腺炎小鼠模型中发现，与NK1R(+/+)小鼠相比，NK1R的遗传缺失使小鼠120h的死亡率从100%降到10%，且显著降低胰腺内中性粒细胞浸润和腺泡坏死。这说明，NK1R的变化影响着急性胰腺炎的严重程度，然而，NK1R拮抗剂是否可以治疗ANP急性肺损伤尚未见报道。本研究中，我们给ANP大鼠应用拮抗剂spantide，观察其对肺损伤是否具有保护作用。结果发现，ANP组6h后肺组织MPO和LCP水平即明显高于正常对照组，并且持续升高(P<0.01)。与正常对照组的各个时间点相比，拮抗剂组肺组织MPO和LCP水平没有明显变化(P>0.05)。免疫组化发现肺泡隔血管内皮细胞表面、肺泡上皮细胞表面、中性粒细胞表面以及细胞间液中均有较高水平的NK1R表达，由此我们推测可能由于过度表达的P物质与炎性细胞如中性粒细胞、单核巨噬细胞以及腺泡细胞、血管内皮细胞上同样高度表达的NK1R结合，引起大量炎症介质、细胞因子的连锁式释放，最终导致ANP急性肺损伤的加剧。NK1R拮抗剂通过阻断P物质与NK1R的结合，很好地阻断ANP急性肺损伤的进展，为NK1R拮抗剂的临床应用提供了实验和理论依据。

　　【参考文献】

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