胰腺癌组织中BRAF表达的初步研究

　　作者： 程张军, 石欣,卫文俊,汤永辉,高乃荣 　(东南大学附属中大医院 普外科，江苏 南京 210009)

　　[摘要]目的：了解BRAF基因在正常胰腺和胰腺癌组织中的表达水平。方法：6例胰腺癌标本取自胰腺癌手术患者，3例正常胰腺组织取自外伤性胰腺损伤需切除部分胰腺者。用Trizol法抽提每份组织的总RNA，分别进行紫外分光光度计测定、琼脂糖凝胶电泳及Lab on chip检测，对总RNA进行质控;应用实时定量PCR技术检测正常胰腺和胰腺癌组织BRAF的mRNA水平;应用Western blot 检测BRAF的蛋白表达水平。结果：BRAF mRNA水平在正常胰腺组织中为0.001 016 7±0.000 25，胰腺癌组织中为0.002 606 2±0.001 09，上调2.56倍;Western blot显示，正常胰腺组织BRAF蛋白表达为6.70±2.50，胰腺癌组织为21.23±5.60，上调3.17倍。结论：胰腺癌组织中BRAF mRNA和蛋白表达水平均明显上调， 其可能的调控机制及生物学效应还有待进一步研究。

　　[关键词] 胰腺癌;BRAF;实时定量聚合酶链反应;Western blot

　　BRAF(vraf murine sarcoma viral oncogene homolog B1)基因是RAF家族成员之一，能诱导禽原代细胞增殖和NIH3T3细胞分化，是一种癌基因。自Davies 等[1]报道约66%的恶性黑色素瘤和15%的结肠癌中BRAF基因存在体细胞错义突变后，该基因与肿瘤关系的研究渐成热点，但其在胰腺癌中的表达尚不清楚。本研究应用实时定量PCR及Western blot技术检测正常胰腺和胰腺癌组织中BRAF的表达水平，以探讨该基因在胰腺癌发生、发展中可能的作用。

　　1 材料和方法

　　1.1 标本来源与病人签署知情同意书后，收集东南大学附属中大医院2004年6～12月胰腺癌手术切除标本7例(C1～C7，其中C5号标本降解弃用)，所有标本均经病理检查证实为胰腺导管腺癌，其中男性3例, 女性3例，年龄56～71岁，平均65.2岁。临床分期采用1987年国际抗癌协会(UICC)的TNM分期标准，其中Ⅰ期1例、Ⅱ期1例、Ⅲ期2例、Ⅳ期2例。正常胰腺组织3例(N1～N3)，取自外伤性胰腺损伤需切除部分胰腺者。手术切除后立即切取标本，快速液氮冷冻，-80℃保存。

　　1.2 主要试剂和仪器TrizolRNA提取试剂盒(Sangon公司)，逆转录酶Superscript Ⅱ(Invitrogen公司)，Sybr GreenⅠ(Invitrogen公司)，Invitrogen RTPCR试剂盒(Invitrogen公司)，QIAGEN RNeasy Kit(QIAGEN公司)，Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent公司)，兔抗人BRAF多克隆抗体sc166(Santa Cruz公司)，羊抗兔抗体(Amersham Biosciences公司)。

　　1.3 总RNA抽提用Trizol法按操作说明抽提每份正常胰腺及胰腺癌组织总RNA。采用无RNA 酶的DNA酶Ⅰ处理，以提高RNA纯度，并使用QIAGEN RNeasy Kit进一步纯化总RNA，操作方法按说明进行。分光光度计测定总RNA的纯度 ，琼脂糖凝胶电泳初步评价总RNA质量，用Agilent2100分析仪通过Labonchip进一步判定RNA样品的完整性。不符合质量标准的总RNA弃用，并重新抽提。

　　1.4 实时定量PCR应用Primer premier5.0软件，参照BRAF基因序列设计引物，上游引物为5′GGCAGAGTGCCTCAAAAAGAA3′，下游引物为5′AACCAGCCCGATTCA AGGA3′，βactin被用作管家基因，上游引物为5′GCAGAAGGAAATCACAGCCCT3′，下游引物为5′GCTGATCCACATCTGCTGGAA3′，由上海博亚公司合成。每份标本取5μg总RNA，在逆转录酶Superscript Ⅱ(Invitrogen公司)作用下合成cDNA，加入引物1μl、荧光染料Sybr GreenⅠ0.5μl，总反应体积25μl，按Invitrogen RTPCR kit操作说明进行PCR扩增，反应条件：50℃孵育2min，95℃ 10min，接着进行45个循环，95℃ 15s，59℃ 1min。定量方法采用比较Ct法。

　　1.5 Western blot分析200mg组织经研磨粉碎，加入1000μl新鲜配制的、冷的蛋白裂解液[50mmol?L-1TrisHCl, pH 7.5, 150mmol?L-1NaCl, 2mmol?L-1EDTA, 质量分数为1%的十二烷基磺酸钠(SDS)，每10ml加入1片蛋白酶抑制剂]，充分裂解后裂解液经4℃、14000r?min-1离心10min，取上清液并测定蛋白浓度。取40μg蛋白与上样缓冲液混合，煮沸5min，置于SDS变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转移到PVDF膜，用1%BSA封闭。稀释度1∶1000的sc166于4℃过夜，加入相应的二抗室温下孵育60min，抗体检查按试剂盒说明书进行。应用GeneSnap软件(GeneGenome Bioimaging, Syngene公司)进行定量分析。

　　2 结 果

　　2.1 总RNA抽提及质量鉴定结果总RNA的OD260/OD280之值在1.8～2.0之间。琼脂糖凝胶电泳，18s和28s电泳条带清晰，28s和18s亮度之比≥2(图1)。Lab on chip检测分析，18s和28s双峰比例及位置均正常，无降解杂峰出现(图2)，说明总RNA纯度高、无降解、质量好。正常胰腺组织 胰腺癌组织

　　2.2 正常胰腺和胰腺癌组织BRAF mRNA表达水平PCR产物的定量方法采用比较Ct法，即先通过一系列的参数设定分析，得到不同样本相对于待测基因的Ct值(Cycle threshold，即每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数)，再根据每个样品的参照基因将目的基因归一化，得到ΔCt=Ct待测基因-Ct管家基因，再转换为起始模板量I=2 ΔCt。根据以上计算方法获得BRAF基因的起始模板量，从而反映出该基因在不同样本中的表达水平[ 2 ]。BRAF基因平均模板量(M)在正常组织中为0.001 016 7±0.000 25，胰腺癌组织中为0.002 606 2±0.001 09(表1、图3)，与正常胰腺组织相比，胰腺癌组织中BRAF基因表达上调2.56倍。图3 正常胰腺和胰腺癌组织中BRAF基因的表达注：I为起始模板量，M为平均模板量

　　2.3 正常胰腺和胰腺癌组织BRAF蛋白表达的水平提取正常胰腺和胰腺癌组织的蛋白作Western blot分析，比较BRAF的蛋白表达。结果表明，所有正常胰腺组织只有很弱的BRAF蛋白表达，而胰腺癌组织中则有较强的BRAF蛋白表达。经过计算机扫描后定量分析，BRAF蛋白表达正常胰腺组织为6.70±2.50，胰腺癌组织为21.23±5.60，上调3.17倍(图4)。图4 Western blot检查BRAF在正常胰腺和胰腺癌组织中的表达

　　3 讨 论

　　BRAF基因位于染色体7q34，长约190kb，转录mRNA长2.5kb，编码783氨基酸的蛋白，分子质量为94~95kDa[3]。在经典的RAS/RAF/MEK/ERK/ MAPK(MEK为mitogen/extracellular signalregulated kinase, ERK为extracellular signalregulated kinase, MAPK为mitogenactivated protein kinase)通路中，BRAF有着重要的作用，是RAS最为关键的效应分子，对MEK/ERK的激活最为重要[45]。与其它两种RAF蛋白(ARAF、RAF1)不同，除神经、睾丸和脾脏外的正常组织中，BRAF表达极低或不表达[4]，但其MEK激酶活性却显著高于ARAF和RAF1蛋白[6]。BRAF激活后能依次磷酸化并激活MEK和ERK，在细胞的不同位置存在多种ERK底物，包括转录因子、核糖体蛋白、酶和细胞骨架蛋白等，持续激活的ERK能影响多种癌的肿瘤标志物[78]。因此，维持BRAF基因的正常对维持细胞的正常功能非常重要，一旦该基因表达改变，就会使生物学功能发生紊乱，使其介导的信号通路失调控，最终导致细胞转化甚至恶变。 本研究应用实时定量PCR及Western blot技术，检测了3例正常胰腺、6例胰腺癌组织中BRAF mRNA和蛋白水平，发现BRAF在胰腺癌组织中的表达明显高于正常胰腺组织。由于目前对该基因与胰腺癌的相关性研究仍很少，我们推测其表达水平的上调可能由其上游的KRAS或Rap1基因的改变引起，或由其自身的激活性突变或基因扩增所导致，是否存在其他调节机制尚不清楚。本研究结果提示，BRAF过表达对胰腺癌发生和发展的生物学意义值得进一步研究。由于样本例数限制，BRAF这种表达差异是否具有统计学意义，以及胰腺癌中BRAF基因表达水平是否与临床病理分期及淋巴结转移有关，尚待进一步探讨。

　　[参考文献]

　　[1]DAVIES H, BIGNELL G R, COX C, et al. Mutations of the BRAF gene in human cancer[J]. Nature, 2002, 417: 949954.

　　[2]CHANG J T, CHEN I H, LIAO C T, et al. A reverse transcription comparative realtime PCR method for quantitative detection of angiogenic growth factors in head and neck cancer patients[J]. Clin Biochem, 2002, 35: 591596.

　　[3]MEYER P, SERGI C, GARBE C. Polymorphisms of the BRAF gene predispose males to malignant melanoma[J]. J Carcinog, 2003, 2: 711.

　　[4]HUSER M, LUCKETT J, CHILOECHES A, et al. MEK kinase activity is not necessary for Raf1 function[J]. EMBO J, 2001, 20: 19401951.

　　[5]MIKULA M, SCHREIBER M, HUSAK Z, et al. Embryonic lethality and fetal liver apoptosis in mice lacking the craf1 gene[J]. EMBO J, 2001, 20: 19521962.

　　[6]MERCER K E, PRITCHARD C A. Raf proteins and cancer: BRaf is identified as a mutational target[J]. Biochim Biophys Acta, 2003, 1653: 2540.

　　[7]PEARSON G, ROBINSON F, BEERSGIBSON T, et al. Mitogenactivated protein (MAP) kinase pathways: regulation and physiological functions[J]. Endocr Rev, 2001, 22: 153183.

　　[8]HANAHAN D, WEINBERG R A. The hallmarks of cancer[J]. Cell, 2000, 100: 5770.