人大肠癌裸鼠皮下移植瘤模型的建立

　　作者：张东兴　颜登国　赵丙波 作者单位：(贵阳医学院附院 普外科， 贵州 贵阳 550004)

　　【摘要】 目的： 建立人大肠癌裸鼠皮下移植瘤模型的方法。 方法： 从新鲜的人大肠癌标本上切取肿瘤组织，移植于裸鼠皮下，原代移植成功后再进行传代，观察裸鼠摄食、活动状况、成瘤时间、成瘤率、潜伏期、肿瘤生长情况、移植瘤大小及组织病理学变化。结果： 原代肿瘤移植成功率为40%，传代肿瘤移植成功率为75%，原代移植肿瘤及传代移植肿瘤组织形态学特征均与患者原发肿瘤保持一致。结论： 初步建立了一种有效的人大肠癌裸鼠皮下移植瘤模型，为大肠癌的研究奠定了基础。

　　【关键词】 癌; 大肠; 肿瘤移植; 疾病模型，动物; 小鼠，裸

　　Establishment of Subcutaneous Transplatation Tumor Models of Human Colon Carcinoma with Nude Mice

　　ZHANG Dongxing，YAN Dengguo， ZHAO Bingbo

　　(Department of General Surgery,the Affiliated Hospital of Guiyang Medical College, Guiyang 550004, Guizhou，China)

　　[Abstract] Objective: To study methods for establishment of subcutaneous transplantation models of human colorectal carcinoma with nude mice. Methods： Fresh tissues of colorectal carcinoma were collected, and transplanted into subcutaneous places of nude mice. The successfully transplanted primary generation tumor was then passed down to further generations. Feeding and activity status of tumorbearing mice，formation time, survival rate， latency， growth and size of the tumor were observed. Histophathological changes of tumor were checked. Results： Survival rate was 40% for primarily transplanted tumor, and was 75% for passage tumors. The morphological characteristics of primary tumor and further generations of tumors were consistent with those of original tumor. Conclusion： The subcutaneously xenotransplanted tumor model of human colorectal carcinoma with nude mice has been successfully established, which provides a basis for individualization studies of colorectal carcinoma patients.

　　[Key words] carcinoma; intestine, large; neoplasm transplantation; disease models, animal; mice,nude

　　在动物体内建立人类疾病模型可以更好地模拟活体状态下疾病的特征，为疾病病因研究和治疗提供实验材料。裸小鼠因为免疫功能的缺陷，特别适合于人类肿瘤异种移植，借助裸鼠移植模型进行肿瘤细胞传代，可将人体肿瘤细胞保存下来以进行各种医学研究。大肠癌是消化道常见的恶性肿瘤之一，大肠癌的病因机制以及抗肿瘤治疗，以往采用人大肠癌细胞株移植瘤动物模型,由于细胞株来源单一，对于需要研究个体化治疗有一定的局限性。2009年9月～12月，采用新鲜大肠癌组织接种于裸鼠体内，观察其生长特征，希望建立一种新的裸鼠大肠癌活体模型，为大肠癌的研究提供一种新的模型系统。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物

　　BALB/c1nu/nu裸鼠购于上海斯莱克实验动物有限责任公司动物中心(许可证编号SCXK，2007-0005，SPF级)，3～4周龄，体重16～22 g，雌雄均可，但同一批次为同性别。寄养于贵阳医学院动物中心，在恒温25～27 ℃、恒湿(45%～50%)、新鲜空气、除尘除菌的无特殊病原菌(SPF级)饲养室条件下饲养。动物先放于有机玻璃盒内，再置于超净生物层流架内，每个饲养盒内饲养5～6只动物，经无菌处理的水和饲料供动物自由摄入，高温消毒的饲料，垫料每三天更换一次，笼具及饮水瓶每三天紫外线消毒一次，饮用无菌蒸馏水。更换饲养用品时严格遵循无菌原则操作。

　　1.2 大肠癌组织来源

　　大肠癌组织源于肛肠外科收治的结、直肠癌患者，术前组织活检及术后病理检查证实为大肠癌，且术前未行放疗和化疗。

　　1.3 实验方法

　　1.3.1 原代裸鼠移植瘤模型

　　从刚离体的4例大肠癌标本上切取肿瘤边缘鱼肉样的无坏死肿瘤组织，用生理盐水反复冲洗后浸泡于含双抗(青霉素和链霉素各500 U/ml)的RPMI1640液中，放入冰盒中迅速送往实验室，在无菌超净工作台上取出标本，放入培养皿中，用含双抗的PBS液反复冲洗，剪除标本外部的脂肪及坏死组织;在培养皿中，用眼科剪将组织剪成1 mm3小块;用戊巴比妥钠腹腔(70 mg/kg)麻醉裸鼠，用镊子将组织块塞到20号穿刺针的针孔中，移植于裸鼠腋下皮下组织内，或于裸鼠皮肤上剪一小切口，由切口在皮下组织内适度分离出一小腔隙，用眼科镊将肿瘤组织块植入腔隙内，缝合切口。每例病人的肿瘤标本为1组，共4组，每组接种10只裸鼠，共40只。

　　1.3.2 传代裸鼠移植瘤模型

　　选择原代移植成功，且肿瘤生长良好的的荷瘤鼠，每组取1只进行传代，共4只。用拉脱颈椎法处死动物，体表消毒，无菌剖出移植瘤组织，浸于适量的RPMI1640液中，将肿瘤组织放入玻璃匀浆器中，加适量无菌生理盐水研磨后，经滤网过滤成单个的细胞悬液，用台盼蓝染色法计数活细胞数，将细胞浓度调整至5×106～5×107/ml，用1 ml的注射器注射到裸鼠腋下部皮下，每点接种0.2 ml，每组接种25只。

　　1.3.3 裸鼠成瘤情况

　　每日观察裸鼠精神、饮食、活动、大小便等一般情况，接种后7～14 d观察是否成瘤，成瘤后每周由同一测量者用游标卡尺测量肿瘤的最大直径(Dmax)和最小直径(Dmin )，按公式V= 1/2×Dmax×(Dmin)2计算肿瘤体积，并画出肿瘤体积时间生长曲线，待原代荷瘤裸鼠的瘤体达500 mm3(约30 d)时取出其中1～2只裸鼠的移植瘤进行传代，具体操作步骤同1.3.2，并取部分组织进行病理学检查。传代荷瘤裸鼠在移植瘤体积平均值约为100 mm3左右的时候，即可选取其中瘤体大小较为一致的部分裸鼠开始给予化疗药物研究。

　　1.3.4 病理形态学检查

　　拉颈处死动物后剖出实体肿瘤组织，10%甲醛固定，制作石蜡切片，苏木素-伊红(HE)染色，行光镜下病理形态学观察。取各代的移植瘤，并与患者原发肿瘤进行对比。

　　2 结果

　　2.1 裸鼠移植瘤成活率

　　原代接种40只，成活16只，成功率为40%(16/40);传代接种100只，成活75只，成功率为75% (75/100)。见表1。表1 裸鼠皮下移植瘤成活率及潜伏期(略)

　　2.2 移植瘤增殖状况

　　接种后每日观察荷瘤裸鼠的生活情况，接种部位出现肉眼可见的移植瘤时为潜伏期结束，记录潜伏期时间及肿瘤外观，之后每周测量计算肿瘤体积，绘制移植瘤的生长曲线。连续观察传代裸鼠移植瘤63 d，生长曲线见图1。各组裸鼠摄食正常,活动状况好,无中途死亡。肿瘤呈膨胀性局限性生长,未见明显浸润或转移发生。接种不成功裸鼠组织块于7～12 d内被机体吸收而消失，原代与传代裸鼠皮下移植瘤在接种后潜伏期约10～17 d，见表1。经过潜伏期后，瘤体随着时间延长逐渐增长，后期生长减慢，个别伴有肿瘤颜色发黑及坏死，见图2。

　　2.3.1 大体标本

　　移植瘤呈圆形或椭圆形，边界较清楚,有纤维包膜包裹，切面中央可见呈灰黄色的坏死组织，周边为生长旺盛组织，厚度1.5～ 2 mm。

　　2.3.2 光镜观察

　　原代移植瘤及传代移植瘤组织学形态与患者原发大肠癌标本病理形态学相比较基本相同(见图2)。荷瘤鼠的肝、肺组织未见肿瘤转移。

　　3 讨论

　　在大肠癌的肿瘤生物学与治疗学研究中，各种实验模型具有重要的作用。1969年Rygaaid[1]首次成功地将人类肿瘤移于无胸腺裸鼠，由于机体主要依靠特异性细胞免疫杀伤肿瘤细胞，而裸鼠无T淋巴细胞，在SPF环境可生存18个月，被人们称为活的试管[2]，这为异种肿瘤移植开辟了新路径。移植后的人肿瘤细胞在裸鼠体内仍保持原有的组织学形态、免疫学特征、特有的染色体组型及对抗癌药物的反应特性，同时这些瘤株能防止由传代伴随的形态和功能的退化，是研究人类肿瘤较为理想的模型系统。

　　人类肿瘤在免疫缺陷动物体内建立的异种移植瘤来源一般有3种：手术活检标本、癌性胸水或腹水标本、体外培养的癌细胞系[3]，活检标本常因组织块太小，不易存活。目前裸鼠肿瘤移植瘤模型多数是通过体外细胞培养的细胞系(或细胞株)注入裸鼠体内而成，其优点是成瘤率较高及稳定，其缺点是对于某些方面的研究存在较大的缺陷，如研究某一个体对化疗药物的反应等。本研究直接利用人大肠癌肿瘤新鲜组织接种于裸小鼠皮下建立模型获得成功。

　　将人类肿瘤移植在裸小鼠身上使其生长发育，目前常用以下两种接种方法。(1)癌组织块法[4]：在无菌条件下，把肿瘤切成1～2 mm3小块，直接将瘤块接种于皮下或原位器官，在肾包膜下移植成功率较高，但不利于肿瘤的观察，原位器官移植多用于建立肿瘤转移模型，Guenot等[5]用此方法对临床B期～D期的结肠癌组织块进行皮下种植并传代研究，未见肿瘤的遗传学特性和组织学特性的改变;(2)癌细胞悬液法[4]：肿瘤组织块研磨后做成细胞悬液、体外培养的细胞系(或细胞株)以及产生腹水的肿瘤细胞，可用1 ml注射器吸取一定数量的细胞后直接注入裸鼠皮下、原位器官或腹腔内。一般情况下，瘤组织块法接种能较好地保持肿瘤细胞形态，接种后成瘤率较高;肿瘤细胞悬液接种法对瘤组织破坏比较严重，成瘤率偏低，但是均一度相对较好。本研究原代肿瘤移植采用瘤组织块接种法，种植部位选用皮下，实验操作相对简单，结果显示成瘤率为40%。传代时应用细胞悬液接种法，使造模后的裸鼠皮下移植瘤大小较一致，以利于试验应用。与患者肠道肿瘤标本相比，裸鼠皮下接种后形成的移植瘤处于无菌状态，容易成活，因此传代时也有较高的成瘤率。

　　从本实验结果来看，除了肿瘤组织的类型及要求足够的细胞数量等基本因素外，影响裸鼠移植瘤成瘤率的高低还有以下因素。(1)取材：取材时一般从肿瘤生长活跃、无坏死的边缘部位取材，这些部位所含活细胞较多，接种成瘤率高;反之在肿瘤中心取材，则可能含较多坏死细胞，得不到足够量的活细胞;传代时应从原代移植瘤中选取实体肿瘤，排除囊性或坏死较多的肿瘤。(2)注意无菌操作：由于结、直肠内含有大量的细菌，而裸鼠又属于免疫缺陷动物，因此切取肿瘤标本后应用含双抗的培养液反复冲洗，达到无菌要求，以提高成瘤率。(3)种植的时限：标本离体后，应浸润于含双抗的RPMI1640液中，并尽量于1 h内接种于裸鼠体内，时间越早，组织越新鲜，成瘤率也越高。(4)移植技术：切口要缝合，防止裸鼠活动后肿瘤组织自切口内逸出。(5)裸鼠的鼠龄：裸鼠缺乏T细胞，但具有体液免疫功能，随着鼠龄的延长，免疫力逐渐升高，导致移植不易成功;肿瘤移植多采用3～4周龄裸鼠，此时自然杀伤细胞的活性较低，移植易成功，因此，年幼的动物比成年的动物为好。(6)裸鼠的饲养：除保持饲料无菌外，还应给予充足的营养，以供肿瘤组织生长。

　　根据生长曲线发现，从肿瘤移植到瘤体出现快速生长之间有一定的潜伏期,本实验为10～17 d，在这之前进行其它实验,则不能排除移植不成功的可能。还应注意，皮下移植瘤虽在某些方面成功地模拟了人恶性肿瘤的特性,但多数呈局限性生长,很少发生肝、肺、脾等脏器和淋巴结转移[6],故未能完全表达恶性肿瘤的生物学特性，难以用于与肿瘤转移相关的研究。另外，由于裸鼠先天性免疫缺陷，一般不用于免疫药物的研究[2]。

　　肿瘤动物模型水平的研究比体外肿瘤细胞培养水平的研究更能模拟人体内的肿瘤生长情况，因此,在细胞水平研究的基础上进一步行动物模型水平的研究是肿瘤防治研究的重要一步。人体肿瘤移植给免疫缺陷动物后能保持人体肿瘤固有的生物学特征，产生的病理改变类似于人体[7]。皮下种植模型具有成功率高，操作简单，便于观察，肿瘤生长速度快等优点，是研究实体瘤生长、相关肿瘤因子检测、药物疗效评定等较好的病理模型[8]。为确保种植后小鼠实体瘤大小均一，种植细胞悬液一定要呈均相，否则，肿瘤生长速度个体差异很大[9]。本实验直接利用人大肠癌肿瘤组织接种于裸小鼠皮下建立模型，观察其成瘤率。该模型简单易行，而且大肠癌组织块建立模型取材较方便，希望为下一步肿瘤的个体化研究，如每一位大肠癌患者的化疗药物实验提供一个可行的研究平台。从实验结果看，一代和二代成瘤率分别达到40%和75%，移植瘤的组织病理和生物学特性与人体原发肿瘤相同，所建模型有利于对干预效果进行观察, 也有助于更深入地研究结肠癌发病机制、抗肿瘤药物的干预作用机制以及筛选新型抗肿瘤药物。

　　【参考文献】

　　[1]　Rygaard J, Povlsen C. O. Heterotransplantation of a human malignant tumor to nude mice. Act Path Microbiol Scand, 1969(77):758-760.

　　[2]　刘建文，季光，魏东芝.药理实验方法学[M].北京：化学工业出版社2003：21.

　　[3]　司徒振强，吴军正.细胞培养[M].第2版.西安:世界图书出版公司,2007:173.

　　[4]　涂经楷，傅仲学.大肠癌裸鼠移植模型研究进展[J].中华消化外科杂志2009：318-320.

　　[5]　Genot D，Guerin E，AguillonRomain S，et a1.Primary tumour genetic alterations and intratumoral heterogeneity are maintained in xenografts of human colon cancers showing chromosome instability [J].Pathol，2006(5)：643-652.

　　[6]　刘芳莉,李饪,高凌寒,等.RAB5A基因表达改变对人肺腺癌细胞系GLC82和SPCal的分化和侵袭特性影响.遗传学报,2002(12):1043-1047.

　　[7]　李幼平.医学实验技术的原理与选择[M].第1版.北京:人民卫生出版社.2008:28.

　　[8]　Wang W，Kim SH，El-Deiry WS.Smallmolecule modulators of p53 family signaling and antitumor effects in p53deficient human colon tumor xenografts[J].Proc Natl Acad Sci USA，2006(29)：11003-11008.

　　[9]　张宝来，臧凯宏，高琲，等.种植肿瘤细胞数对小鼠皮下移植瘤生长及抗癌药疗效的影响[J].中国临床药理学与治疗学，2004(12)：1388-1392.