癫疒间大鼠海马齿状回微管相关蛋白2表达规律及地西泮干预的研究

癫疒间大鼠海马齿状回微管相关蛋白2表达规律及地西泮干预的研究作者：王胜军，迟兆富，陈雯，赵彦新，迟令懿    作者单位：250012济南，山东大学齐鲁医院神经内科（王胜军,迟兆富,陈雯），神经外科（迟令懿）；济南市中心医院神经内科（赵彦新）    【摘要】  目的 研究致疒间大鼠神经元树突标记物微管相关蛋白2（MAP2）的表达规律、与癫疒间发生的关系及在地西泮干预下的变化。方法 建立戊四氮致疒间大鼠模型，分为戊四氮生理盐水组、戊四氮地西泮组、地西泮戊四氮组及正常对照组。采用免疫组化方法观察大鼠疒间后海马结构MAP2免疫反应性(MAP2IR)，及其在地西泮干预下的动态变化，用平均吸光度值(COD)表示免疫反应性的强度。结果 戊四氮生理盐水组及戊四氮地西泮组海马齿状回分子细胞层MAP2 IR的COD值于疒间后3 d增强(均P<005)，7 d明显增强(均P<001)，14 d达到高峰(均P<001)，28 d降至正常对照组水平；地西泮戊四氮组未能观察到MAP2的明显变化。结论 致疒间大鼠海马齿状回MAP2IR变化显著，疒间后的地西泮干预不能改变MAP2IR的变化规律。    【关键词】  癫疒间；微管相关蛋白；地西泮；戊四氮　　Changing features of microtubule associated protein 2 expression in hippocampal dentate gyrus of epileptic rats and the intervention results after using Diazepam WANG Shengjun, CHI Zhaofu, CHEN Wen, et al.　Department of Neurology, Qilu Hospital of Shandong University, Jinan 250012, China　　Abstract：Objective  To investigate the changing features of microtubule associated protein 2 (MAP2)  expression, which was a neural dendrite marker, of epileptic rat and the intervention results after using Diazepam. The relations between MAP2 and epileptogenesis were also explored.Methods  Model of epileptic rat was established by Pentylenetetrazol (PTZ) and divided into PTZNA group,PTZDiazepam group, DiazepamPTZ group and normal control group.  Immunohistochemistry method was applied on hippocampus of epileptic rats to determine the change of MAP2 immunoreactivity (MAP2IR) with or without Diazepam intervention at various time points. MAP2IR was showed by mean optical density (COD).Results  In the PTZNA group and PTZDiazepam group， MAP2IR in molecular cell layer of hippocampal dentate gyrus increased after 3 days (all P<005), boosted obviously after 7 days (all P<001)，reached peak after 14 days (all P<001) and came back to normal level after 28 days of epilptogenesis. In contrast, no marked change was observed in DiazepamPTZ team. Conclusions  Marked changes of MAP2IR are found in hippocampal dentate gyrus after PTZ induced seizure, while Diazepam used after seizure has no notable effect on MAP2IR change.　　Key words：epilepsy;MAP2;Diazepam;Pentylenetetrazol　　微管相关蛋白2（MAP2）是一种热稳定的磷蛋白，主要分布于神经元的胞体及树突内，对神经元发育、突起形成和突触可塑性调节都具有重要作用。多种癫疒间动物模型证实，癫疒间发作后海马齿状回神经元树突内的MAP2显著增加［1］，提示MAP2可能参与突触重塑。本实验通过建立戊四氮(PTZ)致疒间大鼠模型，运用免疫组化方法研究癫疒间大鼠在地西泮干预后MAP2的变化。1  材料与方法　　1.1  动物与分组  雄性6～8周龄Wistar大鼠64只，质量200～350 g。随机分为正常对照组（A组，4只）、PTZ生理盐水组（B组，20只）；PTZ地西泮组（C组，20只）；地西泮PTZ组（D组，20只）。其中，B组、C组及D组又分为致疒间后1 d、3 d、7 d、14 d及28 d 5个亚组，每亚组4只。　　1.2  方法　　1.2.1  动物模型建立  应用1.5%PTZ，以50 mg/kg的剂量对B组、C组及D组大鼠进行腹腔注射，B组、C组数min后出现持续性全身强直阵挛发作，当出现3 min以上超过Ⅳ级（Racine分级法）的持续发作即为成功的癫疒间模型。 B组大鼠在癫疒间发作10 min后腹腔注射10 mg/kg生理盐水；C组在癫疒间发作10 min后腹腔注射10 mg/kg地西泮；D组在腹腔注射PTZ前10 min注射10 mg/kg地西泮。　　1.2.2  标本取材  各组大鼠于相应时间点用0.4%戊巴比妥钠50 mg/kg麻醉，开胸，经升主动脉用生理盐水50 ml冲净血液，4%多聚甲醛磷酸缓冲液(PB,pH 7.4) 180 ml灌注固定。快速取脑入4%多聚甲醛后继续固定36～48 h（4℃）后，常规石蜡包埋,海马连续冠状切片，片厚5 μm,每隔5张取2片,每例标本（双侧海马结构）取切片不少于6张。　　1.2.3  免疫组化染色  切片脱蜡至水；0.3%H2O2溶液孵育10 min；切片加30 μl正常血清室温下孵育30 min；30 μl单克隆兔抗MAP2（1∶1000）室温下孵育24 h；30 μl生物素标记的羊抗兔IgG室温下孵育2 h；30 μl ABC复合物室温下孵育2 h；30 μl DAB液显色5 min,再加H2O2成终浓度001%,呈色10 min。捞片、脱水、透明、封片。对照实验切片用PBS代替MAP2单克隆抗体作上述操作处理，结果为阴性。用Olympus显微镜观察海马各区及齿状回的形态结构，运用MPIAS2500多媒体彩色病理图文分析系统测定齿状回分子层,以光密度值(OD值)表示MAP2免疫反应性的强度,每个部位测定10视野的OD值，同时测定同一张切片的胼胝体的OD值(ODb)作为背景,计算出校正OD值(COD值)。每例标本检测5张切片,用最终的平均COD值代表MAP2IR的强弱。　　1.2.4  统计学方法  所有数据以均数±标准差(±s)表示，分别作成组设计F检验和两两比较的q检验，应用SSPS 10.0软件进行统计学处理。2  结果　　2.1  动物行为学观察  B组和C组大鼠在注射PTZ后1～2 min即出现自由活动减少，头面部肌肉轻微抽搐，伴有须动、耳抖等动作；3～5 min后出现明显的抽搐发作，表现为前肢阵挛，后肢站立，头偏向一侧，摔倒及全身强直阵挛发作，伴有口角流涎，肢端青紫。发作5～10 min后，抽搐渐缓停止，呼吸恢复正常，肢端红润。两组大鼠除1只因持续抽搐超过10 min死亡外，均达到Racine分级的Ⅳ~Ⅴ级标准。D组大鼠在注射PTZ 5 min后仅2只出现前肢阵挛Ⅲ级发作，其余大鼠仅出现须动﹑点头﹑湿狗样抖动等Ⅰ~Ⅱ级发作。A组大鼠行为正常。　　2.2  疒间后各期海马结构MAP2的变化  A组大鼠齿状回内MAP2主要存在于颗粒细胞及齿状回门区神经元的树突内，胞体内也有少量存在。B组大鼠疒间后3 d，齿状回内分子细胞层的MAP2的COD值增高；疒间后7 d，COD值继续增高（P<001），MAP2IR表现为丝状，围绕颗粒细胞层呈放射性分布，并扩展到外分子层；疒间后14 d，MAP2IR贯穿整个分子层形成了一个密集带（P<001）；疒间后28 d，齿状回颗粒细胞树突内MAP2的COD值减低至正常对照组水平。C组大鼠MAP2IR变化特点接近于B组，二者COD值在各个时期差异无显著性；D组大鼠虽然也有一定的增强，但与A组的差异不显著。见表１。　　表1  各实验组不同时间点海马齿状回分子层MAP2 COD值的比较（略）　　注：与A组比较*Ｐ<0.05,**Ｐ<0.013  讨论　　PTZ是一种中枢神经系统兴奋剂，其所诱发的大鼠癫疒间发作的行为与其他方法大致相同。PTZ诱导的大鼠癫疒间持续状态所产生的急性、慢性组织学改变与人类全身惊厥性癫疒间持续状态的病理变化也具有很大的相似性［2］，故该模型是研究癫疒间后海马组织结构损害的一种理想模型。大量的研究［3~6］结果表明，癫疒间发作后会造成海马结构的损伤，包括锥体细胞的坏死﹑凋亡，胶质细胞增生，苔藓样纤维出芽，突触结构的重建等改变。目前，疒间后中枢神经系统可塑性的改变已被认为是癫疒间反复发作﹑难以治愈的重要病理机制。研究［7］发现，癫疒间发作后，海马CA1、CA3区锥体细胞损伤严重，伴有明显的树突萎缩、分支减少，而齿状回神经元受累不明显，相反，出现了细胞树突增殖，基突（苔藓样纤维）过度生长的现象。部分学者［8］认为过度生长的基突延伸至门区形成异常的兴奋性突触环路很可能就是癫疒间反复发作的组织学基础。MAP2是微管结构性蛋白之一,主要在中枢神经系统神经元胞体和树突表达。MAP2与微管连接促进微管的稳定,以磷酸化依赖性方式调节微管动力学,它对于微管稳定、神经元树突的发生、延长都有重要作用。Kato等［9］发现点燃后大鼠海马颗粒细胞层及杏仁海马区都有明显的MAP2IR增高，MAP2IR增高与树突内微管的增多相平行。作者还发现齿状回颗粒细胞多形性微管束的体积、数量都明显增多，但杏仁海马区的神经元内微管束仅数量增加，体积变化并不大。进一步的电镜超微结构研究发现疒间后大鼠的齿状回分子层会出现近端轴突分支现象，与正常情况下的轴突从远端发出﹑近端不分支的特点明显不同。这些异常的分支与光镜下颗粒细胞轴突出芽（苔藓纤维）吻合，发生的时间也一致，这很可能是由于MAP2活性增强，促进微管聚合、新的神经元侧突形成所致［10］。在正常大鼠,CA3区锥体细胞层接受齿状回颗粒细胞的苔藓纤维传入,而齿状回分子层内带接受CA3区锥体细胞和齿状回门区神经元的连合联络纤维。癫疒间损伤后，苔藓纤维与原靶细胞的联系中断；新触发的苔藓纤维异常出芽，一方面回返入分子层与颗粒细胞树突，另一方面穿过CA3体细胞层与CA3始层细胞建立突触联系，构成异常的兴奋环路，激动信号在环路中不断振荡，自我放大、增强，提高了海马的兴奋性，最终导致慢性自发性癫疒间的形成［11］。不过，Sloviter［12］认为苔藓纤维异常出芽不仅在颗粒细胞之间建立了兴奋环路，同时也恢复了对抑制性中间神经元的兴奋性传入，增加了其对颗粒细胞的侧旁抑制，在一定程度上拮抗了兴奋性环路的作用，抑制了癫疒间的形成，故认为，在疒间后突触重建的过程中，抑制系统功能的缺失还是明显存在的，表现为点燃后大鼠会长时期地出现自发的低强度癫疒间样抽搐。本研究结果显示，致疒间后B组大鼠海马齿状回分子层MAP2IR表现出了一个动态的变化过程：COD值3 d开始升高，在14 d达到高峰，约28 d后恢复至正常；研究结果还显示C组大鼠较B组大鼠在各个时期MAP2IR均无明显的差异。这提示一次强烈的癫疒间抽搐发作即可造成神经元的损伤，出现明显的树突结构改变。应用地西泮虽然可以减少大鼠抽搐发作的程度，但却不能改变海马结构的损害及修复过程的发生。D组大鼠没出现类似B组、C组大鼠的MAP2IR变化，很可能是由于地西泮减弱了PTZ的中枢兴奋毒性而维持了神经元微管结构的稳定。可能的机制是，地西泮抑制了持续的强直阵挛发作中神经元异常放电导致钙内流，阻止了钙激活蛋白酶激活，保护了MAP2正常的磷酸化状态，从而消除了癫疒间发作所造成的神经细胞骨架损害［13］。本研究结果可提示，地西泮虽未能明显改变疒间后MAP2的反应性，但它可以有效地预防癫疒间发作，保护海马神经元免受伤害，从而在一定程度上抑制苔藓纤维出芽和突触重建，防止自发性癫疒间的形成。【参考文献】　　［1］Folkerts MM,Berman RF,Muizelaar JP,et al.Disruption of MAP2 immunostaining in rat hippocampus after traumatic brain injury［J］.J Neurotrauma,1998,15:349.　　［2］Fountain NB,Lothman EW.Pathophysiology of status epileptics［J］.J Clin Neurophysiology,1995,12: 326.　　［3］Wenzel HJ, Wolley CS, Robbins CA, et al. 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