大剂量甲基泼尼松龙对大鼠脊髓损伤早期单核细胞趋化蛋白1表达水平和巨噬细胞浸润的影响

大剂量甲基泼尼松龙对大鼠脊髓损伤早期单核细胞趋化蛋白1表达水平和巨噬细胞浸润的影响作者：马胜忠,汤继文,张雪松,张晶涛    作者单位：250012济南，山东大学齐鲁医院骨伤科    【摘要】  目的 探讨大剂量甲基泼尼松龙（MP）对脊髓损伤早期单核细胞趋化蛋白1（MCP1）表达水平和巨噬细胞浸润的影响。方法 采用Nystrm法制备大鼠脊髓损伤模型。将72只雄性SD大鼠随机分为脊髓损伤组、生理盐水对照组、MP治疗组，每组又分为3个亚组，分别于损伤后1 d、3 d、7 d取材。进行HE染色及形态学观察；免疫组化检测MCP1阳性细胞、巨噬细胞的分布。并对以上3组各个时间点的细胞数进行计数及比较。结果 MP治疗组的MCP1阳性细胞、巨噬细胞数明显少于其他两组，而Olsiwski小体的平均密度值增加（均P<005）。结论 脊髓损伤早期MP可以减少损伤区域MCP1的表达水平及巨噬细胞的浸润，并减轻脊髓继发性损伤的程度。    【关键词】  脊髓损伤；甲基泼尼松龙；单核细胞趋化蛋白1；巨噬细胞　　Effects of large dose Methylprednisolone on level of MCP1 expression and macrophages infiltration in early spinal cord injured rats MA Shengzhong, TANG Jiwen, ZHANG Xuesong, et al.Department of Orthopaedics, Qilu Hospital of Shandong University, Jinan 250012, China　　Abstract：Objective  To explore the effects of Methylprednisolone (MP) on level of monocyte chemoattractant protein 1 (MCP1) expression  and macrophages infiltration in early spinal cord injured (SCI) rats.Methods  Animal SCI model was established by modified Nystrm method. 72 rats were randomly divided into three groups: SCI group, normal saline control group and MP treatment group. Each group，divided into three subgroups, were sacrificed at 1 d, 3 d, 7 d postinjury. Spinal cord tissues were collected and sections were made to do following examinations: (1)morphological observation by hematoxylin and eosin  stain；(2)the expression and distribution of local MCP1 positive cells, and the infiltration of macrophages by immunohistochemical method. The cell population of different time points were counted and compared.Results  MP reduced the proportion of both MCP1 positive cells and marcrophages in local spinal cord, meanwhile MP elevated the mean density of Olsiwski corpuscle at all time points as compared with those in control group (all P<005).Conclusions  MP can provide neurotrophic function by inhibiting both the level of MCP1 expression and the macrophages infiltration, thereby meliorating the degree of secondary injury after SCI.　　Key words：spinal cord injury；Methylprednisolone；MCP1；macrophage　　研究［1，2］发现，脊髓损伤早期损伤区域有大量外周循环中的单核/巨噬细胞浸润，参与局部炎症免疫反应，从而加重了脊髓的继发性损伤。而炎症细胞趋化因子单核细胞趋化蛋白1（MCP1）在“招募”外周单核/巨噬细胞进入损伤区域的过程中发挥主要作用。大剂量甲基泼尼松龙（MP）作为脊髓损伤早期公认的治疗药物，通过阻止类脂化物的过氧化反应来减轻脊髓损伤后神经元的变性。而MP能否干预MCP1的作用，目前尚无定论。为此，本研究旨在从炎症免疫反应角度探讨MP对脊髓损伤局部MCP1表达的影响，为MP的临床应用提供理论基础。1  材料与方法　　1.1  动物与分组  健康雄性SD大鼠72只，购于山东大学实验动物中心。质量250～300 g，平均375 g。随机分为脊髓损伤组（SCI组）、生理盐水对照组（NS组）、MP治疗组（MP组）。各组损伤后(1 d、3 d、7 d)又分为3个亚组，每亚组8只。　　1.2  方法　　1.2.1  动物模型制备  实验动物经02％戊巴比妥钠腹腔麻醉后俯卧位固定在立体定向仪上。取后正中切口，去毛、消毒，逐层进入，暴露T8~9段脊髓，注意保持硬脊膜完整;固定两端棘突。采用改良Nystrm法［3］后路压迫大鼠胸段脊髓。压迫装置采用一根长8 cm立柱，其顶端为一直径4 cm圆板，底部有一2.2 mm×5 mm 弧形（凹面向下）光滑金属垫片。立柱穿于长4 cm的光滑塑料管中，使其能上、下滑动。圆板、立柱及垫片的总重量为10.0 g。将塑料管固定于立体定向仪的立臂上，在圆板上加25 g砝码，调整立臂位置，使金属垫片刚好压迫于T8~9脊髓背侧。压迫总重量为35.0 g，压迫时间为5 min，造成大鼠胸髓损伤。术后逐层缝合伤口，置于加热灯泡箱中保暖。药物均经大鼠尾静脉滴入。MP组术后即刻以MP(由法玛西亚普强公司、比利时分厂生产) 30 mg/kg静脉滴注15 min，间隔45 min后，改为5.4 mg/(kg·h) 静脉滴注23 h。NS组则在相同时间内静脉滴注等量的生理盐水。动物麻醉清醒后温室隔离喂养，每1～2 d挤压或穿刺排尿1次。　　1.2.2  标本制作和染色  损伤后1 d、3 d、7 d取材。动物腹腔麻醉后，4％多聚甲醛500 ml经心灌注固定，完整取出损伤区脊髓，置于4％多聚甲醛（室温）固定12 h。制作石蜡切片，片厚4 μm，行HE染色、Olsiwski小体染色（甲苯胺蓝法）及MCP1阳性细胞、巨噬细胞免疫组化染色。MCP1阳性细胞、巨噬细胞染色采用ABC法，主要过程包括：H2O2甲醇封闭内源性过氧化物酶，正常绵羊血清阻断，胰酶消化，PBS漂洗。加入适当稀释的一抗（MCP1单抗稀释为1∶800，巨噬细胞单抗稀释为1∶500），4℃，冰箱孵育过夜。加生物素化二抗和ABC复合物孵育。DAB显色(巨噬细胞单抗购自Antigenix公司，MCP1抗体及ABC试剂盒购自Sigma公司) 。　　1.2.3  图像分析  在CAP530图像采取卡（中国自动化技术研究所生产）、IBMAT286和Olympus BX60组成的图像处理系统上进行显微图像分析。MCP1阳性细胞、巨噬细胞由计算机自动计数，胞浆Olsiwski小体计算灰度。　　1.2.4  统计学方法  所测数据以均数±标准差(±s)表示，组间相同时间点的比较采用t检验。2  结果　　2.1  HE染色、Olsiwski小体染色  SCI组及NS组的损伤区域水肿明显，灰白质内出血、坏死，神经元空泡变性，核浓缩、偏位。Olsiwski小体稀少，许多神经元胞浆内Olsiwski小体几乎消失。而MP组的上述改变较前两组为轻。3组神经元Olsiwski小体平均密度值比较见表1。　　2.2  MCP1阳性细胞、巨噬细胞染色  胞质呈棕黄色的细胞为MCP1阳性细胞，SCI组及NS组的损伤区域灰白质内可见阳性细胞较多，并见较多破裂细胞，染色较深，主要以弥漫的形式分布在靠近血管区域及血管壁上。胞质内溶酶体膜呈棕黄色的细胞为巨噬细胞，胞体较大，损伤区域灰白质内血管内外分布稠密。MP组的MCP1阳性细胞及巨噬细胞分布区域与前两组相似，但密度较稀。见图1、图2、表2。　　表1  SCI组、NS组、MP组不同时间点Olsiwski小体平均密度值比较（略）　　注：与SCI组及NS组比较*P<005　　图1  SCI后3 d损伤区域MCP1阳性细胞染色(×40)（略） 　　A：SCI组阳性细胞增多；B：MP组阳性细胞减少 　　图2  SCI后7 d损伤区域巨噬细胞染色(×20)（略） 　　C：SCI组巨噬细胞增多；D：MP组巨噬细胞减少3  讨论　　3.1  脊髓损伤早期MCP1的作用机制  脊髓损伤一般由原发性损伤和继发性损伤造成。后者通常是一种细胞和分子水平的主动调节过程，有许多因素参与，如：兴奋性氨基酸、过氧化基团、细胞凋亡基因、炎症细胞因子等。在脊髓继发性损伤的炎症免疫反应机制研究中，一些学者［1，4］认为，脊髓损伤早期，损伤区域的残存小胶质细胞、血管内皮细胞等受局部微环境改变的刺激而被活化，释放炎症细胞因子，如：肿瘤坏死因子（TNFα）、白介素1β（IL1β）等。后者能使胞浆内的IκBα磷酸化并降解，引起核因子κB（NFκB）的释放并转移到核内引起一系列的基因表达，从而导致细胞分泌趋化因子［5,6］。这些因子在细胞间黏附分子1（ICAM1）等的作用下，介导外周炎症免疫细胞侵入损伤区域，来参与脊髓继发性损伤。属于趋化因子CC亚家族的MCP1主要招募外周循环中单核/巨噬细胞等。MCP1还可引起单核/巨噬细胞胞浆内游离钙水平升高、呼吸爆发、表达ICAM1（如β2整合素）、释放溶酶体酶及超氧阴离子等 ［4］。而单核/巨噬细胞的作用主要包括: 微血管闭塞、氧自由基产生、细胞毒性酶释放、血管舒缩性改变等［7］，由此来加重脊髓继发性损伤。　　表2  各组SCI后1 d、3 d、7 d损伤区域MCP1阳性细胞及巨噬细胞计数的比较（略）　　注：与SCI组及NS组比较*P<005　　3.2  MP对脊髓损伤早期MCP1表达的影响  早期大剂量使用MP能显著控制SCI后的炎症反应，并减轻继发性损伤的程度，是目前临床上治疗脊髓损伤早期的首选药物。在上世纪90年代初，Hall［8］就证实MP对脊髓损伤保护作用的最主要机制是抑制脂质过氧化，有利于脊髓神经元细胞膜的稳定。本实验结果中也发现脊髓损伤早期用MP干预后神经元Olsiwski小体平均密度值明显增高，提示MP对残存的脊髓神经元具有保护作用。而有关MP对脊髓损伤早期MCP1表达的影响，国内外少有文献报道。只有Press等［9］证实，GuillainBarre综合征与慢性脱髓鞘性神经根炎患者经过静脉注射MP治疗后，患者脑脊液中MCP1表达水平较治疗前降低。国内周丽宏等［10］研究大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，发现在缺血前后使用MP脑组织血管周围巨噬细胞浸润明显减少。本实验发现在脊髓损伤早期（24 h内）给予大剂量MP治疗能够明显减少损伤局部MCP1阳性细胞数，同时减少巨噬细胞的浸润。MP影响脊髓损伤早期MCP1表达的作用机制目前尚不清楚。推测可能有， NFκB和糖皮质激素受体是炎症免疫反应中两个重要的调节因子，它们在免疫反应调节中起完全相反的作用。MP作为一种合成的糖皮质激素，作用时与糖皮质激素受体结合，促使后者活化而抑制NFκB活化基因的表达，最终降低MCP1的表达水平。【参考文献】　　［1］Lee YL,Shih K,Bao P,et al.Cytokine chemokine expression in contused rat spinal cord ［J］.Neurochem Int,2000,36: 417.　　［2］马胜忠，侯铁胜，张雪松，等.大鼠脊髓损伤后炎症细胞趋化因子MCP1的表达及其意义［J］.第二军医大学学报，2004， 25：766.　　［3］Nystrm B,Berglund JE,Bergquist E.Methodological analysis of an experimental spinal cord compression model in the rat ［J］.Acta Neurol Scand,1988,78: 460.　　［4］Ghirnikar RS,Lee YL,Eng LF,et al.Inflammation in traumatic brain injury: role of cytokine and chemokines［J］.Neurochem Res,1998,23:329.　　［5］Beauparlant P,Hiscott J.Biological and biochemical inhibitors of the NFкB /Rel proteins and cytokines synthesis［J］.Cytokine Growth Factor Rev,1999,7: 175.　　［6］Ping D,Boekhoudu GH,Rogers EM,et al.Nuclear factorкB P65 mediates the assembly and activation of the TNFresponsive element of the murine monocyte chemoattractant1 gene［J］.J Immunol,1999,162: 727.　　［7］de Graba TJ.The role of inflammation after acute stroke:utility of pursuing antiadhesion molecule therapy［J］.Neurology,1998,51:62.　　［8］Hall ED. The neuroprotective pharmacology of methylprednisolone ［J］.Neurosurg,1992,76:13.　　［9］Press R, Pashenkov M, Jin JP, et al. Aberrated levels of cerebrospinal fluid chemokines in GuillainBarre syndrome and chronic inflammatory demyelinating polyradiculoneuropathy ［J］.J Clin Immunol,2003,23: 259.　　［10］周丽宏，王嗣欣， 王芳芳，等.大剂量甲基泼尼松龙对大鼠局灶性缺血再灌注脑损伤的影响［J］.临床神经病学杂志，2000，13：332.