VEGF单克隆抗体在胰腺缺血再灌注损伤中的保护作用

　　作者：谢嵘， 范昕， 张建新 作者单位：江苏大学附属医院普外科， 江苏 镇江 212001

　　【摘要】目的： 探讨VEGF单克隆抗体对胰腺缺血再灌注(ischemiareperfusion,I/R)损伤的保护作用及其机制。方法： 采用钳闭大鼠腹腔干、肠系膜上动脉制备胰腺缺血再灌注损伤模型。应用ELISA试剂检测VEGF，TNFα表达，并应用TUNEL法检测胰腺细胞凋亡，RTPCR，蛋白质印迹法和免疫组织化学染色检测胰腺组织中Fas，FasL mRNA和蛋白的表达情况。结果： I/R组血清中的TNFα，VEGF明显高于VEGF单抗组(P<0.01)。I/R组胰腺组织中TUNEL染色见典型的细胞核固缩及凋亡小体形成。应用VEGF单克隆抗体后，胰腺组织中胰腺细胞凋亡指数明显下降。和I/R组相比，胰腺组织中Fas， FasL mRNA和蛋白表达水平均明显降低，免疫组化亦显示Fas，FasL在VEGF单抗组中显色弱于I/R组。结论: VEGF单克隆抗体可以降低I/R过程中TNFα，VEGF表达水平，并且抑制Fas的表达,抑制过度凋亡，减轻缺血再灌注对胰腺的损伤。

　　【关键词】 胰腺; 缺血再灌注; 细胞凋亡; VEGF单克隆抗体; Fas/FasL

　　Effect of VEGF MCAb in ischemiareperfusion injury　in pancreas of rats

　　XIE Rong, Fan Xin, ZHANG Jianxin

　　(Department of General Surgery, the Affiliated Hospital of Jiangsu University, Zhenjiang Jiangsu 212001, China)

　　[Abstract]Objective: To study the effect and mechanism of VEGF MCAb in preventing ischemiareperfusion injury. Methods： Ischemiareperfusion models were made by ligated both the anterior menseneric artery and the celiac artery of 70 rats. The expression of TNFα，VEGF was detected by ELISA. Apoptosis of pancreatic acinar cells was examined by terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTPbiot in nick end labeling(TUNEL) method. The expression of Fas, FasL mRNA and protein were detected by RealTime PCR, Western Blot and immunohistochemistry in rat pancreatic samples.Results: Compared with ischemiareperfusion group, VEGFMCAb can significantly decrease the level of TNFα，VEGF in serum and apoptosis index. The expression level of Fas, FasL mRNA and protein in I/R group was significant higher than pancreatic tissue in group treating with VEGFMCAb. In I/R group, Fas, FasL immunoreactivity was more intense than in corresponding VEGFMCAb treated tissue. Conclusion: VEGFMCAb can protect pancreas against ischemiareperfusion injury and can inhibit excessive apoptosis through downregulation of Fas/FasL.

　　[Key words]pancreas; ischemiareperfusion; apoptosis; VEGF MCAb; Fas/FasL

　　急性胰腺炎是一种起病急、变化快、病情复杂的疾病,其发病机制至今仍不清楚。近年来,胰腺微循环、细胞因子、炎症介质在急性胰腺炎发病机理中的作用越来越受到重视[1]。有证据显示胰腺炎中伴有明显的血流障碍和脓毒症过程[2]，并且在缺血再灌注早期即有血管内皮生长因子(VEGF)及肿瘤坏死因子α(TNFα)等因子的表达[3]。

　　本实验中我们观察了胰腺缺血再灌注损伤中VEGF，TNFα的表达情况，探讨VEGF单克隆抗体对胰腺缺血再灌注损伤的保护作用，现报告如下。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物及主要试剂

　　清洁级SD大鼠共70只，雌雄不限(江苏大学医学院实验动物中心提供)。VEGF单克隆抗体购自Santa Cruz 公司;VEGF，TNFα ELISA试剂盒，免疫组化试剂盒购自Biotech 公司产品;TUNEL试剂盒购自Boehringer Mannheim 公司。

　　1.2 动物分组及模型建立

　　成年SD大鼠70 只，随机分为3组：对照组(10只)、缺血再灌注损伤(I/R)组(30只)和VEGF单克隆抗体(VEGF单抗)组(30只);I/R组和VEGF单抗组再分15，30，60 min 3个时间点，每组10只。动物模型制作：术前12 h 禁食不禁水， 0.5 %戊巴比妥钠45 mg/kg腹腔注射麻醉，腹正中切开，找到腹腔干和肠系膜上动脉。对照组不用血管铗钳闭腹腔干和肠系膜上动脉，直接取胰腺组织标本，心脏穿刺取血2 ml; I/R组和VEGF单抗组分别以血管夹阻断腹腔干和肠系膜上动脉15，30，60 min(各10只)后再灌注6 h，取标本。VEGF单抗组于术前5 min尾静脉注射VEGF单克隆抗体100 μg/300 g，I/R组仅注射等量生理盐水。

　　1.3 血清淀粉酶，VEGF, TNFα表达测定

　　按照试剂盒说明书进行检测。

　　1.4 凋亡指数检测

　　胰腺组织常规石蜡切片，二甲苯脱蜡， 梯度乙醇水化，0.1 mol/L的PBS 缓冲液洗涤3次， 每次5 min。2 mg/L的蛋白酶K消化， 室温15 min。0.3%的过氧化氢-甲醇溶液处理，室温30 min，PBS洗涤。以下步骤按试剂盒说明操作，光镜下计算凋亡指数。凋亡指数(apoptosis index，AI)计算方法：数4个高倍视野，分别计算凋亡细胞数和总细胞数，AI=凋亡细胞数/总细胞数×100%。

　　1.5 RealTime PCR分析Fas，FasL mRNA表达

　　各组大鼠胰腺组织的RNA采用TRIzol试剂按相关使用说明进行提取，然后用MMLV逆转录试剂盒进行逆转。取2 μg总的RNA，在25 μl体系中逆转成cDNA，用于RealTime PCR检测。Fas引物序列：正向5′TGAAGGACATGGCTTAGAAGTG3′， 反向5′GGTGCAAGGGTCACAGTGTT3′;FasL引物序列：正向5′GCAGCCCTTCAATTACCCAT3′， 反向5′CAGAGGTTGGACAGGGAAGAA3′。以β肌动蛋白为内参，引物序列：正向5′GATCATTGCTCCTCCTGAGC 3′，反向5′ACTCCTGCTTGCTGATCCAC3′。使用LightCyclerDNA Master SYBR Green I mix(Roche Applied Science)进行扩增反应。所有反应均一式三份，在iCycler iQ system(BioRed)上进行。每对引物的扩增产物均进行熔解曲线及DNA凝胶电泳分析。

　　1.6 蛋白质印迹分析Fas，FasL蛋白表达

　　取胰腺组织放入液氮中冷冻，取出研碎后用RIPA 缓冲液冰上裂解15 min，10 000×g 4℃离心15 min，用Bradford试剂测定蛋白浓度，取等量蛋白样品加入6×SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳样品缓冲液，煮沸5 min变性后进行10%PAGE电泳，转膜，显色。一抗为鼠抗Fas，FasL单抗，二抗为HRP标记的鼠抗IgG。

　　1.7 免疫组织化学染色

　　胰腺组织采用Envision两步法进行免疫组化染色。各组胰腺标本组织中性甲醛溶液固定，石蜡包埋，5 μm连续切片，按Envision两步法试剂盒说明操作。

　　1.8 统计学处理

　　应用SPSS16. 0统计分析软件进行统计学处理。实验数据以均数±标准差表示，采用单因素方差分析进行各组间比较。检验水准α=0.05。

　　2 结果

　　2.1 三组血清淀粉酶，TNFα，VEGF测定结果

　　I/R组和VEGF单抗组各时间点血清淀粉酶均显著高于对照组(P<0.01)，且随时间推移呈逐渐升高趋势;VEGF单抗组各时间点血清淀粉酶均较同期I/R组明显下降(P<0.01)。对照组有TNFα，VEGF一过性的升高，I/R组和VEGF单抗组各时间点的TNFα，VEGF均显著高于对照组(P<0.01)，随着缺血时间的延长呈逐渐升高趋势;VEGF单抗组各时间点TNFα，VEGF均明显低于同期I/R组(P<0.01)。见表1。

　　2.2 胰腺细胞的凋亡情况

　　对照组中有少量腺泡细胞的凋亡，且组内各时间点凋亡指数相当。I/R组及VEGF单抗组的凋亡指数随着缺血时间的延长，逐渐加重，均明显高于同期对照组(P<0.01)。VEGF单抗组凋亡指数均明显低于同期I/R组(P<0.01)。见表2。表1 三组大鼠各时间点血清淀粉酶，TNFα，VEGF表达情况，表2 各组凋亡指数的比较(略)。

　　2.3 Fas，FasL在胰腺组织中的表达

　　2.3.1 Fas，FasL mRNA表达

　　与对照组相比，Fas，FasL mRNA在I/R组胰腺组织中表达上调，VEGF单抗组亦有上调，但是其上调水平明显低于I/R组。统计结果显示，两组Fas，FasL mRNA表达水平差异有统计学意义(P<0.05)。见图1，2。

　　2.3.2 Fas，FasL蛋白表达

　　为了研究Fas，FasL mRNA表达变化是否与Fas，FasL的蛋白水平一致，我们从上述标本中每个时间点随机抽取两对标本，提取蛋白进行蛋白质印迹检测。结果显示，在对照组，I/R组及VEGF单抗组中，Fas，FasL蛋白表达水平与Fas，FasL mRNA表达水平一致。见图3，4。

　　2.3.3 免疫组化染色结果

　　对照组胰腺组织见较弱的凋亡调控基因Fas的表达，I/R组和VEGF单抗组中Fas染色明显增强。但是与I/R组相比，VEGF单抗干预后各时间点胰腺细胞Fas染色阳性率明显降低。各组中均没有见到胰腺腺泡细胞中FasL 表达,但是在间质中均可见浸润的炎性细胞FasL 免疫组化染色阳性。见图5。

　　3 讨论

　　有研究显示在急性胰腺炎早期，胰腺的血流有急剧下降再上升的过程，具有缺血再灌注的特征表现[4]，即胰腺炎的发生过程中存在着缺血再灌注现象。Hoffmann 等[5]通过暂时阻断大鼠胰腺动脉供应建立的I/R模型,成功地复制出急性坏死性胰腺炎(acute necrosis pancreatitis，ANP),进一步证实了I/R 在ANP 发病中的作用。

　　VEGF 又称血管通透因子(vascular permeability factor, VPF), 它是一种二聚糖,蛋白相对分子质量为45,由两个相同的亚基组成[6]。血管内皮细胞正常时不表达VEGF,但在血管内皮细胞被置于缺氧环境时细胞内VEGF mRNA水平明显增加[7,8]。早期研究工作发现，生长因子促进内皮细胞分裂、再生和迁移,抑制内膜增生,有助于促进在完全阻塞血栓中产生再通血管,促进周围侧支循环建立和改善内皮细胞依赖性血管舒张的作用[9,10 ]。但最近对肝缺血再灌注中的研究发现，VEGF在体内有与其前炎症功能相关的有害作用[3]。

　　TNFα是参与免疫的重要因子，低浓度时可以引起特异性免疫和炎症反应，防御病原微生物，浓度过高时则导致一系列炎症反应。众多研究表明，急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)时大量TNFα是AP由局部病变发生为全身炎症反应的始动因素，能引发一系列级联反应，诱导IL1，IL6的产生，引起毛细血管通透性的增加，加重炎症反应，作为炎症的始动因子，其水平与AP的预后及重症急性胰腺炎的发生率显著相关。

　　在本实验中，我们发现在胰腺缺血再灌注早期，组织缺氧刺激下，VEGF表达显著增加，在再灌注2～6 h后达到高峰，以后逐渐下降。与对照组相比，VEGF单抗组和缺血再灌注组的VEGF水平明显升高;与缺血再灌注组相比，VEGF单抗组血清中的VEGF含量显著下降，细胞损伤减轻，提示VEGF是胰腺炎病程中造成胰腺细胞损伤的重要介质。同时，我们发现，在缺血再灌注损伤时，不单有VEGF的参与，也有前炎症因子TNFα和细胞凋亡的参与。

　　为了研究VEGF单克隆抗体抑制胰腺细胞凋亡的机制，我们研究了各组大鼠胰腺组织中细胞表面死亡受体通路Fas/FasL的表达变化。结果显示，给予VEGF单克隆抗体后，胰腺细胞的Fas表达明显下降;浸润的炎症细胞明显减少，其表面表达的FasL明显弱于I/R组;病理损害明显减轻。上述结果提示，VEGF单克隆抗体可能通过抑制胰腺细胞的过度凋亡来减轻缺血再灌注对于胰腺的损伤。

　　以上结果表明，VEGF单克隆抗体可以保护胰腺细胞对于缺血再灌注损伤的耐受性，该作用与抑制炎症因子的瀑布样反应有关。同时其可以抑制凋亡相关蛋白Fas/FasL表达，减少胰腺细胞在缺血再灌注中过度凋亡。因此，在急性胰腺炎早期，给予VEGF单克隆抗体可能是一个新的治疗选择。

　　【参考文献】

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