血清对氧磷酯酶1活性及其基因多态性与动脉粥样硬化性血栓性脑梗死关系的研究
发表时间：2010-02-25 浏览次数：550次
血清对氧磷酯酶1活性及其基因多态性与动脉粥样硬化性血栓性脑梗死关系的研究作者：宋云,田桂玲, 王彤宇,王景华 作者单位：250014济南，山东省千佛山医院神经内科（宋云）；天津医科大学总医院神经内科 （田桂玲,王彤宇，王景华） 【摘要】 目的 研究中国汉族人血清对氧磷酯酶1（PON1）活性及PON1Q/R192基因多态性与动脉粥样硬化性血栓性脑梗死（ATCI）的关系。方法 采用紫外线分光光度法和聚合酶链式反应限制性片段长度多态性(PCRRELP)方法，检测48例ATCI患者和55名相匹配的健康人血清PON1活性及PON1Q/R192基因多态性。结果 ATCI组血清PON1活性为(74.41± 18.85) U/ml，明显低于健康对照组［（113.65±26.64）Ｕ/ml］（P<0.05）。ATCI组与健康对照组等位基因频率分别为Q：37%及43%；R：63%及57%，两组间等位基因频率及3种基因型分布差异无统计学意义。结论 血清PON1活性降低是ATCI的危险因素之一；PON1Q/R192基因多态性与中国汉族人ATCI的发生无相关性。 【关键词】 对氧磷酯酶1;脑梗死;基因多态性 Study the relationship between the serum paraoxonase1 activity and its gene polymorphism and atherosclerotic thrombotic cerebral infarction SONG Yun, TIAN Guiling, WANG Tongyu,et al.Department of Neurology, Qianfushan Hospital, Jinan 250014，China Abstract：Objective To study the relationship between the serum paraoxonase1(PON1) activity, PON1Q/R192 polymorphism and atherosclerotic thrombotic cerebral infarction(ATCI) in Chinese Han people.Methods In 48 cases with ATCI and 55 normal controls (NC group), serum PON1 activity was assayed by infrared spectrophotometer;the PON1Q/R192 polymorphism was determined by polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism.Results Serum PON1 activity in the ATCI group was significantly lower than that in NC group［(74.41±18.85) U/ml,（113.65±26.64） U/ml, P＜0.05］. In the groups ATCI and NC,allele frequencies were Q：37%，43%；R：63%，57% respectively，there was no significant difference between them. Distributional difference of three genetypes in two groups were also no significant difference.Conclusions Low serum PON1 activity is one of the risk factors of ATCI. There is no significant relationship between PON1Q/R192 polymorphism and ATCI in Chinese Han people. Key words：paraoxonase1;cerebral infarction;gene polymorphism 近年来研究发现，血清对氧磷酯酶1（PON1）能通过多种途径抑制动脉粥样硬化的发生发展，且PON1基因192Q/R（谷氨酰胺Gln/精氨酸Arg）多态性也可能与动脉粥样硬化的发生发展有关。本研究通过对照分析，旨在探讨中国汉族人血清PON1活性、PON1Q/R192基因多态性与动脉粥样硬化性血栓性脑梗死（ATCI）的关系。1 对象与方法 1.1 对象 所有研究对象均为天津地区无亲缘关系的汉族人。（1）ATCI组：系2003年4～7月天津医科大学总医院神经科住院的ATCI患者48例，均符合全国第四届脑血管病学术会议修订的诊断标准，并经头颅CT或MRI证实。其中男28例，女20例；年龄45～80岁，平均（63.2±11.3）岁；病程14～35 d，平均(21.6±6.8)d。(2)健康对照组：系同期天津地区常规体检者55名，男34人，女21人；年龄45～80岁，平均（59.8±8.7）岁；无心脑血管病史、症状、体征、实验室检查及心电图依据，无严重感染及肝肾功能不全。两组年龄、性别相匹配。 1.2 方法 1.2.1 DNA的提取 被检者于清晨空腹取静脉血1 ml，EDTA抗凝，用TKM法［1］提取基因组DNA。 1.2.2 聚合酶链式反应（PCR） 扩增包含PON1192位点的基因片段。上游引物5′TATTGTTGCTGTGGGACCTGAG3′,下游引物3′CACGCTAAACCCAAATACATCTC5′［3］ 。PCR反应体系：总体积50 μl，DNA模板1.0～2.0 μg，4×dNTP 20 nmol/L，10×PCR buffer 5 μl，Tag DNA聚合酶1 μl，加无菌双蒸水至终体积50 μl。扩增条件：94℃预变性5 min，94℃变性1 min，61℃退火1 min，72℃延伸1 min，循环扩增35个周期，72℃继续延伸10 min。PCR扩增产物片段长度为99 bp，使用含0.5 μg/ml EB的1.8%琼脂糖凝胶电泳，以相对分子质量20～500 bp Marker为标准检测扩增产物，于紫外线投射仪下观察结果。 1.2.3 限制性片段长度多态性 取PCR产物10 μl，ALWI限制性内切酶1.6 μl，10×buffer 2.5 μl，加无菌双蒸水至终体积25 μl。混匀后，37℃水浴4 h，酶切产物在含0.5 μg /ml EB 3%琼脂糖凝胶电泳。 1.2.4 PON1活性测定 被检者均于清晨空腹经肘前静脉取血1 ml，立即离心得到血清。采用分光光度法，取反应缓冲液（CaCl2 2 mmol/L，Tris/HCl 0.1 mmol/L，pH 8.0）2.6 ml，加入5 mmol/L酚乙酸酯300 μl，于25℃水浴预温20 min。加入1∶10倍稀释后的血清100 μl，反应90 s后加0.5 mmol/L EDTANa2 200 μl终止。用分光光度计于波长207 nm处测定吸光值，同时设立血清对照和底物对照，通过公式［2］计算PON1活性。 1.2.5 统计学方法 计量数据以均数±标准差(±s)表示，计数数据以比数比表示；采用t检验、χ2检验、方差分析及非条件Logistic回归分析。2 结果 2.1 两组血清PON1活性的比较 ATCI组与健康对照组血清PON1活性分别为（74.41±18.85）U /ml、（113.65±26.64）U/ml，ATCI组显著低于健康对照组（Ｐ<0.01）。 2.2 两组基因型及等位基因频率的比较 见表1。ATCI组与健康对照组间PON1 192位点QQ、QR、RR 3种基因型及Q、R 2种等位基因频率分布差异无统计学意义。 表1 两组PON1 Q/R192基因型及等位基因频率（略） 2.3 ATCI影响因素非条件Logistic回归分析 见表2。血清PON1活性降低与ATCI相关（OR=0.948，Ｐ<0.01），而含R等位基因的基因型QR、RR与ATCI不相关。 2.4 不同PON1 Q/R192基因型者间血清PON1活性的比较 见表3。ATCI组与健康对照组中不同PON1 Q/R192基因型者间血清PON1活性比较差异无统计学意义。 表2 ATCI影响因素非条件Logistic回归分析（略） 表3 不同PON1 Q/R192基因型者间血清PON1活性的比较（略）3 讨论 ATCI发生是基因与环境相互作用的结果，涉及诸多机制，PON1可能在其中发挥一定的作用。PON1是一种相对分子质量约43×103的钙依赖性酯酶，其在体内的天然底物尚不清楚，目前多以酚乙酸酯作为底物检测其活性。研究［3］表明血液中的PON1可与高密度脂蛋白（HDL）中的载脂蛋白（Apo）AI紧密结合，具有酯酶和过氧化物酶两种活性，能水解脂质过氧化物，尤其是氧化磷脂和亚油酸胆固醇酯氢过氧化物，从而抑制脂蛋白的氧化，水解氧化低密度脂蛋白（oxLDL），对抗氧化应激；PON1甚至还能水解动脉粥样硬化斑块中的脂质过氧化物，有可能逆转动脉粥样硬化的过程；另外，PON1还具有水解同型半胱氨酸巯基内酯（HcyTL）的活性，降低其对内皮细胞的损害和对蛋白的修饰，抑制动脉粥样硬化的发生发展。本研究发现ATCI患者的血清PON1活性显著低于健康对照组；多因素分析显示PON1活性降低是ATCI的危险因素之一。一些研究［4］也表明具有冠心病、糖尿病、高脂血症等ATCI的高危人群中，血清PON1活性明显降低。因此，血清PON1活性测定为预测ATCI的发生提供了一条新的途径，并且提高血清PON1活性可能是预防ATCI的有效措施之一。 PON基因多态性也可能与ATCI等动脉粥样硬化性疾病有关。PON基因位于染色体7q21.3q22.1上，含9个外显子，是由PON1、PON2、PON3组成的多基因家族，其中PON1基因在动脉粥样硬化中的作用较受重视。PON1基因编码区存在M/L55（蛋氨酸Met/亮氨酸Leu）、Q/R192（Gln/Arg）两个多态性位点。国外报道［5］欧洲白种人PON1 Q/R 192等位基因频率为71%/29%，基因型为RR、QR的个体易患动脉粥样硬化性疾病，192R等位基因是动脉粥样硬化的独立危险因素。国内报道［6］中国汉族人PON1 Q/R 192等位基因频率为39%/61%～45%/55%，其192R等位基因与动脉粥样硬化性疾病的关系尚存在争议。本研究中ATCI组及健康对照组Q/R等位基因频率及3种基因型频率的分布差异无统计学意义。多因素分析表明PON1 Q/R 192基因多态性与中国汉族人ATCI的发生无相关性。其原因可能与中国汉族人R等位基因出现频率高，掩盖了其与ATCI的关系。另外，取样较少也会导致一定的误差。 本研究表明血清PON1活性与基因多态性之间无明显相关性，不同基因型对血清PON1活性影响不大，在中国汉族人群中，血清PON1活性对ATCI的发生、发展所起的作用比基因多态性更重要。【参考文献】 ［1］Lahiri DK，Schnabel B. 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