硫化氢对大鼠肠缺血再灌注损伤的保护作用
发表时间：2010-06-17 浏览次数：414次
作者：刘浩，白晓斌，史松，曹永孝 作者单位：西安交通大学医学院：1. 第一附属医院普通外科;2. 药理学系，陕西西安 710061
【摘要】 目的 研究硫化氢(H2S)对肠缺血再灌注损伤(I/R)的保护作用，为临床治疗I/R提供新的可能途径。方法 以硫化氢钠(NaHS)为H2S的供体，将40只SD大鼠随机分为假手术组、I/R模型组、川芎嗪对照组、NaHS(7μmol/kg和14μmol/kg)组，每组8只。检测各组血清和小肠组织的超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPx)的含量，观察小肠黏膜病理组织学变化。结果 H2S能显著降低I/R大鼠血清和小肠组织MDA水平，提高SOD、GSHPx水平;小肠黏膜和腺体的损伤较I/R模型组明显减轻。结论 H2S对I/R引起的肠黏膜损伤有保护作用。
【关键词】 硫化氢;缺血再灌注损伤;肠黏膜;大鼠
基金项目：西安市科技计划项目(No.YF07170)
The protective effect of hydrogen sulfideon intestinal ischemiareperfusion injury in rats
Liu Hao, Bai Xiaobin, Shi Song, Cao Yongxiao
1. Department of General Surgery, the First Affiliated Hospital;
2. Department of Pharmacology,Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710061, China
ABSTRACT: Objective To study the protective effect of hydrogen sulfide (H2S) on intestinal ischemiareperfusion (I/R) injury so as to provide a new clinical treatment on I/R. Methods NaHS was taken as a donor of H2S. Forty SpragueDawley rats were divided into 5 groups with 8 rats in each group: sham operation group, I/R model group, tetram ethylpyrazine group, and NaHS 7μmol/kg and 14μmol/kg groups. The contents of superoxidase dismutase (SOD), malondialdehyde (MDA) and glutathione peroxidase (GSHPx) in serum and intestinal tissue were measured, respectively. The intestinal mucosal injury and histological alteration were observed. Results The content of MDA within serum and intestinal tissue was significantly reduced and the activities of SOD and GSHPx were significantly increased. H2S could obviously reduce the injury in intestinal mucosa and glands. Conclusion H2S possesses a protective effect on intestinal I/R injury in rats.
KEY WORDS: hydrogen sulfide; ischemiareperfusion injury; intestinal mucosa; rat
20世纪90年代发现半胱氨酸代谢生成气体分子硫化氢(hydrogen sulfide, H2S)，其作用特点有别于气体信号分子一氧化氮(nitric oxide, NO)及一氧化碳(carbon monoxide, CO)。内源性H2S可直接作用于K(ATP)通道调节血管，对神经系统特别是海马的功能具有调节作用，也可影响血管平滑肌张力[13]。H2S对大鼠心肌缺血再灌注损伤具有保护作用，但对肠缺血再灌注损伤(ischemiareperfusion injury of the intestine, I/R)的保护作用，国内外尚未见报道。本研究以硫化氢钠(NaHS)作为H2S的供体，研究H2S对大鼠肠I/R的保护作用，为临床治疗I/R提供新的可能途径。
1 材料与方法
1.1 动物
雄性SD大鼠，体重200-240g，由西安交通大学医学院动物培养中心提供。
1.2 试剂和药品
NaHS购自美国Sigma公司，川芎嗪注射液购自西安制药厂，超氧化物歧化酶(superoxidase dismutase, SOD)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)及谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSHPx)试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供。
1.3 主要实验仪器
722型光栅分光光度计(上海第三分析仪器厂)，匀浆器(北京玻璃化工厂)和超速离心机(北京医用离心机厂)。
1.4 肠缺血再灌注损伤模型的制作
大鼠禁食过夜，以100g/L的水合氯醛10mL/kg腹腔内注射麻醉后，取右侧卧位，固定于手术台上。左侧腹部、右腹股沟术野备皮、消毒，无菌操作分离右股动脉，插管，接三通管，连接一个含有0.3mL肝素生理盐水(肝素10u/mL)注射器(供抽血和给药用)。取腹膜后入路，分离肠系膜上动脉(SMA)，用无损伤血管夹夹闭其根部，缺血结束后松夹进行再灌注。实验结束时经股动脉取血，并放血处死。
1.5 实验分组
40只大鼠以体重为指标，随机分层为5组，每组8只。假手术组动物进行手术操作但不夹闭肠系膜上动脉。I/R模型组动物进行手术操作并用动脉夹夹闭肠系膜上动脉1h后，去除动脉夹，再灌注1h后，股动脉快速放血处死。川芎嗪组手术操作同模型组，但在夹闭肠系膜上动脉30min时经股动脉给川芎嗪8mg/kg。NaHS 7μmol/kg 和14μmol/kg组手术操作同模型组，但在夹闭肠系膜上动脉30min时分别经股动脉给NaHS 7μmol/kg和14μmol/kg。
1.6 生化指标检测
动物处死时，经股动脉取血2mL，离心取血清;处死后取一段距回盲部5cm重约100mg的回肠(肠壁全层，去系膜)，用眼科剪快速剪碎组织装入试管中，加入匀浆液2mL离心，取上清液。测定血清和肠组织上清液SOD、MDA及GSHPx，按测试盒说明操作。
1.7 组织形态学观察与肠黏膜评分
动物处死后，取距回盲部25cm处回肠5cm，以40g/L多聚甲醛室温下固定24h，300g/L蔗糖4℃过夜沉底，OCT包埋，横冷箱冰冻切片，片厚10μm，室温干燥后常规HE染色。光镜下观察肠黏膜组织学改变。由病理医师在未被告知标本分组的情况下，对每份标本进行定性评估，依损害程度分为正常和轻、中、重4级。判定依据：①大体标本淤血程度和色泽;②肠黏膜和腺体厚度减少损伤程度;③黏膜被覆上皮和腺体坏死脱落及炎细胞浸润程度;④肠壁毛细血管和淋巴管扩张、淤血程度。
1.8 统计学处理
用SPSS10.0 统计软件进行统计分析，采用t检验，P<0.05为差异有显著性。
2 结 果
2.1 H2S对大鼠血清及小肠组织SOD水平的影响
与假手术组比较，I/R模型组血清及小肠组织SOD明显降低(P<0.05，P<0.01);与I/R 模型组比较，川芎嗪组、NaHS组血清及小肠组织SOD均明显升高(P<0.01);与川芎嗪组比较，NaHS两个剂量组的血清及小肠组织SOD均显著性升高(P<0.05，P<0.01，表1)。表1 H2S对大鼠血清及小肠组织SOD变化的影响(略)
2.2 H2S对大鼠血清及小肠组织MDA水平的影响
与假手术组比较，I/R模型组血清及小肠组织MDA明显升高(P<0.01);与I/R 模型组比较，川芎嗪组血清MDA明显降低(P<0.01)，NaHS 7μmol/kg组血清及小肠组织MDA明显降低(P<0.01，P<0.05);NaHS 14μmol/kg组血清及小肠组织MDA明显降低(P<0.01)。NaHS 7μmol/kg和NaHS 14μmol/kg组血清及小肠组织与川芎嗪组比较差异无显著性(P>0.05，表2)。表2 H2S对大鼠血清及小肠组织MDA变化的影响(略)
2.3 H2S对大鼠血清及小肠组织GSHPx水平的影响
与假手术组比较，I/R 模型组血清及小肠组织GSHPx明显降低(P<0.01);与I/R模型组比较，川芎嗪组血清及小肠组织GSHPx明显升高(P<0.05)，NaHS 7μmol/kg组血清及小肠组织GSHPx明显升高(P<0.05，P<0.01);NaHS 14μmol/kg组血清及小肠组织GSHPx明显升高(P<0.01)。NaHS 14μmol/kg组小肠组织GSHPx明显高于川芎嗪组(P<0.01，表3)。表3 H2S对大鼠血清及小肠组织GSHPx变化的影响(略)
2.4 小肠的病理组织学改变
与正常小肠(图1A)比较，I/R模型组肠管显示重度损害，黏膜面可见散在的溃疡和出血灶，镜下可见黏膜上皮细胞脱落，绒毛断裂，尖端上皮抬高，黏膜下层见中性粒细胞浸润，肠壁毛细血管和淋巴管扩张(图1B);川芎嗪组呈中度损害，镜下见黏膜层有少量的上皮细胞脱落，黏膜下见散在的中性粒细胞浸润(图1C);NaHS组呈轻度损害，镜下见绒毛上皮细胞结构完整，有少量中性粒细胞浸润，毛细血管和淋巴管扩张不明显(图1D)。
3 讨 论
I/R是严重创伤、烧伤、休克后常见的病理生理过程，I/R不仅可引起肠道局部组织损伤和肠道内细菌及毒素移位，而且可致肠源性炎症介质和细胞因子释放，引起全身性炎症反应，甚至多器官功能障碍[45]。
H2S作为一种新型的气体信号分子，自上世纪90年代以来一直受到关注。H2S对大鼠心血管组织的保护作用已有比较深入的研究，内源性H2S可以舒张血管平滑肌，降低血压;通过影响丝裂素活化蛋白激酶途径抑制平滑肌细胞增殖;抑制离体心肌收缩功能。静脉注射H2S可产生短暂负性肌力，有降低中心静脉压的作用[67]。NaHS是公认的H2S供体，NaHS可能是机体内H2S的一种存在形式，其在体内可解离呈钠离子和硫氢根离子，后者与体内氢离子结合生成H2S，机体内H2S和NaHS可能形成了一种动态的平衡[8]。
本研究以NaHS为供体，研究H2S对I/R的保护作用。结果发现I/R 模型组血清和小肠组织MDA水平较假手术组明显升高，SOD及GSHPx活性明显降低;I/R 模型组小肠黏膜上皮细胞脱落，绒毛断裂，黏膜固有层可见中性粒细胞浸润，并可见散在的溃疡和出血灶等病理改变。与I/R 模型组比较，NaHS 7μmol/kg和14μmol/kg两个剂量组均可不同程度地显著降低血清和小肠组织MDA活性，提高SOD及GSHPx水平。MDA是脂质过氧化反应的代谢产物，其浓度是膜脂质过氧化损害程度的标志，测定MDA可以间接反映出氧自由基对细胞的损伤程度;SOD能清除氧自由基，保护细胞免受损伤，SOD活性可间接反映出机体清除氧自由基的能力，GSHPx是自由基清除剂，具有抗氧化作用[9]。本组病理组织学检查可见NaHS模型组小肠绒毛上皮细胞完整，未见明显的肠壁毛细血管和淋巴管扩张和中性粒细胞浸润，其损伤程度较I/R 模型组明显减轻。NaHS大剂量组的作用有比小剂量组强的趋势，但无显著性意义，其作用未显示出剂量依赖关系，提示NaHS的有效剂量范围较宽。
组织缺血时，组织细胞内氧的供应减少或中断，细胞的有氧代谢受到抑制，ATP的合成急剧下降，加之无氧代谢产生的有毒酸性产物和氧自由基的大量累积，可以导致细胞内酶活性的改变以及维持跨膜离子梯度的能量缺乏，当严重缺血时可使细胞内环境紊乱，甚至细胞死亡[1011]。H2S可以提高内源性抗氧化酶系统的活性，其中SOD能催化O2歧化为H2O2，继而在GSHPx作用下H2O2降解为H2O和O2，胱硫醚γ裂解酶(CSE)是谷胱甘肽(GSH)合酶的关键酶，H2S使各内源性抗氧化酶不同程度升高，降低了脂质过氧化，减少其产物MDA的生成。H2S可以通过增加内源性抗氧化酶系统活性、直接去除部分的自由基和扩张血管来改善肠缺血再灌注损伤的作用。
川芎嗪(四甲基吡嗪)是从伞形科篙本植物川芎根茎中提取分离的生物碱单位，可人工合成，作为活血化淤药物治疗缺血性疾病，已有研究显示其对家兔I/R有保护作用[2]。本研究用川芎嗪做阳性对照，证明其对大鼠I/R 亦有保护作用。本研究结果显示H2S对I/R大鼠SOD的作用强于川芎嗪，对其余指标的作用与川芎嗪无显著性差异。
综上所述，H2S可明显降低SD大鼠血清和小肠组织MDA活性，提高SOD、GSHPx活性，明显减轻小肠黏膜损伤，提示其对I/R具有良好的保护作用。
【参考文献】
[1]Zhao W, Zhang J, Lu Y, et al. The vasorelaxant effect of H2S as a novel endogenous gaseous KATP channel opener [J]. EMBO J, 2001,20(21): 60086016.
[2]陈悦,单季先. 川芎嗪对家兔肠缺血再灌注损伤作用的实验研究 [J]. 河南大学学报(医学版), 2005, 24(1):3236.
[3]杨昕,黄秀榕, 祁明信,等. 内源性硫化氢—种新型气体信息分子 [J]. 广州医学院学报, 2005,33(2):6568.
[4]Hacioglu A, Algin C, Pasaoglu O, et al. Protective effect of leptin against ischemiareperfusion injury in the rat small intestine [J]. BMC Gastroenterol, 2005,5(37):17.
[5]曹卫红，胡森，孙丹，等. 肠道部分缺血再灌注损伤动物模型的复制 [J]. 创伤外科杂志, 2005,7(1):4649.
[6]叶婷，刘晓城.内源性硫化氢在心血管系统中的作用 [J]. 国外医学内科学分册, 2004，31(11):482494.
[7]常芳，李凌，常庆,等. 硫化氢对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用 [J].中原医刊, 2005,39(9):23.
[8]陈晓波，杜军保，耿彬，等. 硫化氢对培养的大鼠主动脉平滑肌细胞增殖的抑制作用 [J]. 中国病理生理杂志，2003, 19(8):10091011.
[9]于军，景桂霞. 高氧液预处理对心脏瓣膜置换术患者血浆丙二醛和超氧化物歧化酶的影响 [J]. 西安交通大学学报(医学版), 2006 (27):5254.
[10]韩鑫，于明.肠缺血再灌注损伤防治研究进展 [J]. 中华小儿外科杂志, 1999, 20(1):4546.
[11]Gao C, Chai W, Xu L, et al. Protective effects of hyperoxygenated solution preconditioning on intestinal ischemiareperfusion injury in rabbits [J]. J Surg Res, 2006, 135(2):268274.
