头孢曲松钠对谷氨酸诱导皮质神经细胞损伤的影响
发表时间:2010-02-25 浏览次数:492次
头孢曲松钠对谷氨酸诱导皮质神经细胞损伤的影响作者:刘春华,王维治 作者单位:150086哈尔滨,哈尔滨医科大学附属二院神经内科 【摘要】 目的 探讨头孢曲松钠对谷氨酸诱导皮质神经细胞损伤的影响。方法 培养大鼠脑皮质神经细胞,并分为对照组、头孢曲松钠组、谷氨酸组、头孢曲松钠预处理组,观察各组细胞形态,MTT法检测各组细胞活性,激光共聚焦显微镜观察静息及短暂细胞内钙超载下细胞Ca2+变化;逆转录聚合酶链技术检测谷氨酸转运体1(GLT1)mRNA表达。结果 与谷氨酸组比较,头孢曲松钠预处理组神经元形态更接近正常;吸光度值对照组、头孢曲松钠组、谷氨酸组、头孢曲松钠预处理组分别为0.813±0.023、0.795±0.010、0.624±0.028、0.738±0.021,谷氨酸组及头孢曲松钠预处理组明显低于对照组,但头孢曲松钠预处理组明显高于谷氨酸组(均P<0.0001);细胞Ca2+平均荧光强度静息状态下各组分别为141.257±6.165、127.329±12.086、281.400±21.378、220.171±24.061,头孢曲松钠预处理组明显低于谷氨酸组(P<0.01),短暂细胞内钙超载时头孢曲松钠预处理组较谷氨酸组上升缓慢但恢复迅速,且GLT1mRNA表达增加(P<0.01)。结论 头孢曲松钠通过上调GLT1mRNA表达来拮抗细胞内钙超载,减轻谷氨酸神经毒性。 【关键词】 头孢曲松钠;谷氨酸;细胞内钙;谷氨酸转运体 Effects of ceftriaxone on glutamateinduced cerebral cortical neurocyte injury LIU Chunhua, WANG Weizhi.Department of Neurology,The Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Heilongjiang, Harbin 150086, China Abstract:Objective To study the effect of ceftriaxone on glutamateinduced neurocyte injury. Methods Cultured rat cerebral cortical neurocytes were divided into control group, ceftriaxone group, glutamate group and ceftriaxonepretreated group. Observe morphous and MTT colorimetry was used to detect cytoactive. Laser scanning confocal microscope was used to measure the change of Ca2+ in rest and after brief glutamateinduced Ca2+ loading. RTPCR was used to determine the change of GLT1mRNA expression.Results Compared with glutamate group, cellular morphous was closer to normal in ceftriaxonepretreated group. Absorptance value of control group, ceftriaxone group, glutamate group and ceftriaxonepretreated group was 0.813±0.023, 0.795±0.010, 0.624±0.028 and 0.738±0.021 respectively, which were lower in glutamate group and ceftriaxonepretreated group compared with control group, however, Absorptance value was higher in ceftriaxonepretreated group compared with glutamate group(P<0.0001). Mean fluorecence intensity of intracellular Ca2+ in each group was 141.257±6.165, 127.329±12.086, 281.400±21.378 and 220.171±24.061 respectively, which was lower in ceftriaxonepretreated group compared with glutamate group(P<0.01). Calcium levels increased slowlier and restored faster after brief glutamateinduced Ca2+ loading, and expression of GLT1mRNA was much higher in ceftriaxonepretreated group compared with glutamate group(P<0.01).Conclusion Ceftriaxone can resist Ca2+ loading and reduce glutamate neurotoxicity. Key words:Ceftriaxone;glutamate;intracellular calcium;glutamate transporters 在诸多急慢性中枢神经系统损伤,如癫疒间、脑缺血、脑外伤、肌萎缩性侧索硬化症等,谷氨酸可通过细胞内钙超载等一系列级联反应导致神经细胞损伤。人们试图应用钙通道阻滞剂、谷氨酸受体拮抗剂等减轻谷氨酸导致的脑损伤,但临床疗效不尽人意。本研究通过观察头孢曲松钠对谷氨酸诱导的神经细胞损伤的影响,为临床寻找新的脑保护药物。1 材料与方法 1.1 材料 Wistar乳鼠30只,由哈尔滨医科大学附属二院动物实验中心提供;头孢曲松钠、L谷氨酸分别为上海新先锋药业、Sigma公司生产;DMEM高糖培养基、胎牛血清、MTT分别为Gibco、杭州四季青、Sigma公司产品;TRIZOL、ThermoscriptTM RTPCR试剂盒均为Invitrogen公司产品;RTPCR所用引物由上海生工合成;Fluo3/AM、PluronicF127由日本同仁化学研究所提供;其余试剂均为市售分析纯。 1.2 方法 1.2.1 皮质神经细胞培养 根据Guillet等[1]方法并加以改良。无菌分离出生48 h内Wistar乳鼠大脑皮质,PBS冲洗、0.25%胰蛋白酶中剪碎后,37℃充分消化30 min。吸弃表面胰蛋白酶,加入倍量含10%胎牛血清的DMEM高糖培养液终止消化,1000 r/min离心3 min。吸弃上清液,加入培养液制成密度约107的单细胞悬液,接种于涂有多聚赖氨酸的50 ml培养瓶或96孔板,置于37℃、5%CO2培养箱中培养,48 h全量换液,此后每周2次半量换液,倒置显微镜定期观察细胞形态变化。 1.2.2 实验分组及处理 (1)对照组:经如上正常培养11 d的细胞;(2)头孢曲松钠组:细胞经如上培养至8 d时,加入含头孢曲松钠培养液(终浓度1 mmol/L)培养2 d,PBS冲洗后正常培养24 h;(3)谷氨酸组:细胞经如上培养至10 d时,加入含谷氨酸培养液(终浓度50 mmol/L)培养15 min后,换正常培养液继续培养24 h;(4)头孢曲松钠预处理组:细胞经如上培养至8 d时,加入上述含头孢曲松钠培养液培养2 d,PBS冲洗后同谷氨酸组处理。 1.2.3 细胞活性检测 利用MTT比色法,调节各组细胞以104密度接种在96孔板,每组7孔。每孔加入5% MTT20 ml,37℃培养6 h后换100 ml二甲基亚砜溶解震荡5 min,酶标仪(波长492 nm)测各孔吸光度值。吸光度值越大,细胞的活性越高。 1.2.4 细胞内Ca2+测定 避光条件下,将各组培养的细胞接种在96孔板,每组5孔。PBS冲洗后,各孔加入含有Fluo3/AM(终浓度4 mmol/L)和PluronicF127(终浓度0.05%)的无血清的DMEM培养液(每孔100 ml),37℃孵育45 min。不含荧光探针PBS液充分冲洗后加入细胞外液,室温稳定20 min。激光共聚焦显微镜扫描静息状态各组细胞,488 nm氩激光激发Fluo3/AM发出绿色荧光,观察细胞形态、细胞内Ca2+荧光强度(测60 s,间隔10 s/次)。细胞内Ca2+短暂超载(谷氨酸50 μmol/L作用各组细胞2 min)后,同一视野连续动态扫描(间隔6~10 s),观察各组细胞由钙超载恢复到静息状态的能力。每个图像随机选取10个细胞,用Zeiss LSM Image Browser Version 5.0软件分析其细胞内Ca2+荧光强度并取平均值,结果以图表形式输出,监视器下摄影采集图像。 1.2.5 GLT1mRNA检测 采用逆转录聚合酶链反应 (RTPCR)技术,结合基因文库,利用Primer5软件设计GLT1引物:上游5′CTGGGGCCTGGGAAGAAGAACG3′,下游5′CCAGCGGGGAATACCACA3′;βactin:上游5′AGCCATGTACGTAGCCATCC3′,下游5′GCTGTGGTGGTGAAGCTGTA3′,扩增片断长度分别为412 bp、222 bp。“异硫氰酸胍酚氯仿提取法”分别提取各组细胞的RNA,稀释至1 mg/ml用于cDNA合成。取2 ml cDNA加入MgCl2(50 mM)2 ml、10×RNA PCR缓冲液5 ml、dNTP(10 mM)Mix 1 ml、上下游引物各1 ml、Taq酶0.2ml 、DEPC处理水37.8ml,总体积50 ml。PCR梯度扩增仪中95℃5 min;95℃30 s,58℃30 min,72℃60 s,循环35次;72℃10 min。琼脂糖凝胶电泳,EB染色,凝胶图像处理系统半定量分析,表达相对量以(面积×强度)目的基因/(面积×强度)βactin表示。 1.2.6 统计学方法 实验数据以均数±标准差(±s)表示,组间比较采用F检验,所有数据用SPSS 11.0统计软件包进行分析。2 结果 2.1 各组神经细胞形态学特征比较 经培养8 d时,神经元形成明显神经网络。11 d时,对照组:神经元胞体饱满、边界清晰、折光性强;头孢曲松钠组:神经元形态与对照组无差别;谷氨酸组:神经元损伤明显,细胞肿胀,核固缩,折光性降低,突起断裂;头孢曲松钠预处理组:神经元损伤较谷氨酸组明显减轻,形态更接近正常。 2.2 各组神经细胞活性的比较 见表1。与对照组比较,头孢曲松钠组差别无显著性;谷氨酸组及头孢曲松钠预处理组的吸光度值明显降低(均P<0.001),头孢曲松钠预处理组较谷氨酸组吸光度值明显升高(P<0.001)。 表1 各组神经细胞活性、细胞内Ca2+荧光强度及GLT1mRNA表达量的比较(略) 注:与对照组相比*P<0.001;与谷氨酸组相比△P<0.001 2.3 各组细胞内Ca2+荧光强度的比较 见表1、图1。与对照组相比,静息状态下头孢曲松钠组细胞Ca2+荧光强度无改变,谷氨酸组及头孢曲松钠预处理组细胞内Ca2+荧光强度显著增加(均P<0.001);头孢曲松钠预处理组较谷氨酸组细胞Ca2+荧光强度明显降低(P<0.001)。 图1 静息状态下各组神经细胞[Ca2+]i荧光强度(略) 短暂谷氨酸作用后,对照组细胞[Ca2+]i荧光强度由145.333±0.814上升到198.7±6.14,15 min内恢复至静息状态,头孢曲松钠组较之上升缓慢但恢复迅速(由131.533±0.153上升到170.9±3.43,10 min左右恢复至静息状态);谷氨酸组[Ca2+]i荧光强度迅速上升后缓慢恢复(271.367±1.266上升到350.9±4.98),15min内仍未恢复至静息状态,始终明显高于静息水平;头孢曲松钠预处理组较之上升稍缓慢、恢复稍迅速(200.5±0.10上升到250.6±2.61),但也始终明显高于静息水平。见图2。 图2 短暂钙超载时各组细胞[Ca2+]i的荧光强度的动态变化(略) 2.4 各组神经细胞GLT1mRNA表达量的比较 见表1、图3。与对照组相比,头孢曲松钠组GLT1mRNA表达量明显升高(P<0.001),谷氨酸组及头孢曲松钠预处理组表达量降低(均P<0.001);与谷氨酸组相比,头孢曲松钠预处理组GLT1mRNA表达量明显升高(P<0.001)。 图3 各组神经细胞GLT1mRNA电泳图(略)3 讨论 临床上第三代头孢菌素——头孢曲松钠被广泛应用。近年研究发现,头孢曲松钠在神经系统中具有重要作用。在脑皮质神经元电离辐射损伤模型中[2],在电离辐射前1 h应用1 μmol/L头孢曲松钠,可使电离辐射诱导的乳酸脱氢酶(LDH)释放减少87%,DNA破碎减轻;在转基因小鼠肌萎缩侧索硬化模型中[3],长期应用头孢曲松钠可以保留小鼠前爪握力,延缓小鼠病程和质量减轻等症状发生,生存期延长10 d。本实验中,头孢曲松钠预处理的神经细胞能明显减轻谷氨酸对其的损伤,不仅细胞的形态无明显改变,而且极显著提高了神经元活性,降低静息状态细胞Ca2+,增强短暂神经细胞内钙超载状态下细胞回复静息状态的能力,增加了细胞GLT1mRNA的表达量,表明头孢曲松钠能减轻谷氨酸引起的细胞损伤和细胞内钙超载作用,拮抗谷氨酸兴奋性神经毒性,具有神经保护作用。 关于其神经保护作用机制,以往推测头孢曲松钠有1个dα氨基脂肪酸侧链,可拮抗N甲基D门冬氨酸(NMDA)受体在氧化损伤时发生神经元的内源性羟基化作用,从而减少神经元氧化损伤[2]。最新研究[4]发现,正常大鼠腹腔注射头孢曲松钠(200 mg/kg)7 d后,海马和脊髓中的谷氨酸转运体1(GLT1)蛋白表达明显增加,可持续3个月。本研究结果显示,谷氨酸能下调GLT1mRNA表达,头孢曲松钠能上调GLT1mRNA的表达,头孢曲松钠预处理能有效抵抗谷氨酸对GLT1mRNA表达的下调作用。一系列在体、离体实验表明[5],胶质细胞膜上的GLT1可能是目前人类已知的最重要GLTs,其在前脑向胞内转运的谷氨酸占全部谷氨酸摄取的90%。所以,头孢曲松钠神经保护作用的机制可能是通过促进GLT1基因转录,使胞外谷氨酸更多的被转运清除。有报道[6]人类GLT1基因启动子区域存在基本转录因子1(Sp1)、Nmyc原癌基因和核因子κB (NFκB)转录因子结合位点,表皮生长因子(EGF)、转换生长因子α(TGFα)、血小板源性生长因子可通过丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Akt)、细胞外信号调节激酶(ERK)、蛋白激酶A (PKA)、蛋白激酶C (PKC)或NFκB信号途径促进GLT1基因转录,而肿瘤坏死因子α(TNFα)可抑制GLT1基因转录,从而调节GLT1基因的转录率。研究显示,谷氨酸神经毒性中上述一系列因子可发生变化,如TNFα mRNA水平上调、TGFα免疫活性降低,产生神经损害作用。而头孢曲松钠也可能是通过调节上述因子来促进GLT1基因转录而产生神经保护作用。 目前尚无通过GLTs途径来拮抗谷氨酸兴奋性毒性的药物研究,更无能够正向调节GLT1的可应用药物。已知用于中枢神经系统疾病治疗时头孢曲松钠在脑膜可达到的浓度为0.3~6 μM[7],本实验中能有效上调GLT1表达的头孢曲松钠浓度是1 μmol/L,在其治疗浓度范围内。这就为开发作用于GLT1靶点神经保护药物提供新的思考方向,为开辟这种老药的新的临床应用范围提供重要理论依据。【参考文献】 [1]Guillet B, Masmejean SLF, Samuel D,et al. 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