改良三袖套法建立大鼠原位小肠移植模型

　　作者：王秀钰，车向明，樊 林，何纪恩，林子晶，赵 伟 作者单位：(西安交通大学医学院第一附属医院普通外科，陕西西安 710061)

　　【摘要】 目的 改进血管重建，简化手术操作，建立稳定的大鼠原位小肠移植模型。方法 三袖套法行血管重建：供体肠系膜上动脉所带腹主动脉与受体腹主动脉分段由Cuff套管袖套吻合，供体门静脉与受体左肾静脉由Cuff套管袖套吻合。结果 共进行移植30例，成功27例，手术成功率90%。供体手术平均耗时(42±5)min，供肠修整耗时(3±1)min，受体手术耗时(65±10)min，热缺血0min，冷缺血(32±3)min，三次套管共耗时(10±1)min，总手术耗时(160±10)min。结论 严格保护供肠与应用三袖套法重建血管，有助于快捷地建立简便稳定、成功率高、并发症少的大鼠节段性原位小肠移植模型。

　　【关键词】 大鼠;小肠移植;原位;血管重建

　　Modified Tricuff technique for orthotopic small bowel transplantation in ratsWANG Xiuyu, CHE Xiangming, FAN Lin, HE Jien, LIN Zijing, ZHAO Wei

　　(Department of General Surgery, the First Affiliated Hospital,

　　Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710061, China)ABSTRACT: Objective To improve the vascular reconstruction technique, simplify the surgery process and establish a stable animal model for small bowel transplantation (SBT) in rats. Methods Reconstruction of vessels with tricuff technique: Abdominal aorta of the donor attached to the graft was anastomosed to the abdominal aorta of the recipient with two Cuffs separately; the hepatic portal vein of the donor attached to the graft was anastomosed to the left renal vein with a Cuff. Results There were 30 cases of transplantation, 27 of which succeeded with a success rate of 90.0%. The average time of donor operation was (42±5)min, the time for graft chipping was (3±1)min, the time of recipient operation was (65±10)min, the average warm ischemia time was 0min, the average cold ischemia time was (32±3)min, the total time for three times of Cuff anastomosis was (10±1)min, and the total operation time was (160±10)min. Conclusion It is helpful to establish a simple and stable model for SBT in rats by protecting graft intestine strictly and using the triCuff technique, with a higher success rate and fewer complications.

　　KEY WORDS: rat; small bowel transplantation; orthotopic; vascular reconstruction

　　小肠移植是治疗终末期肠功能衰竭的理想方法[1]。由于仍然面临免疫排斥、感染、肠功能恢复等困难，小肠移植的临床发展落后于其他固体器官移植[2]。因此，建立简便稳定的动物模型以开展小肠移植的实验研究具有重要意义。既往报道多提及显微外科操作复杂、血管吻合技术要求较高、手术并发症多和成功率较低等问题，且有学者不断改进建模方法[34]。我们尝试改良的三袖套法完成血管重建，旨在简化操作，提高成功率，更好地建立大鼠小肠移植模型。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物 封闭群健康成年雄性SD大鼠，体重280～320g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。

　　1.2 器材及试剂 显微外科手术器械;自制Cuff套管;70、90无损伤缝合线、50丝线;24G穿刺套管;盐酸氯胺酮、肝素、9g/L氯化钠、乳酸钠林格、安尔碘皮肤消毒液等。

　　1.3 方法

　　1.3.1 术前准备 选用体重相近的大鼠分作供、受体，术前24h禁食，自由饮水。盐酸氯胺酮腹腔注射(100mg/kg体重)，麻醉满意后仰卧位固定，安尔碘消毒腹部皮肤。

　　1.3.2 供体手术 经上自剑突下至耻骨联合的腹部纵形切口入腹，盐水纱布保护肠管，于髂总动脉平面结扎腹主动脉。切除全结肠。结扎并切断左肾静脉、左右肾动脉、腰动脉、腹腔干，游离肠系膜上动脉及其所在的腹主动脉段，得到游离的腹主动脉段近心端距其根部约0.5～1.0cm，远心端约1.5～2.0cm。游离肠系膜上静脉、脾静脉和幽门静脉挂线待用，游离门静脉至肝门。距回盲部5cm起保留20～30cm回肠备移植用。快速结扎切断脾静脉和幽门静脉。动脉夹于腹主动脉游离段两端阻断，远心端处经腹主动脉插管，以30cmH2O(1cmH2O=0.098kPa)压力行小肠原位灌注。灌注液为含肝素100u/mL的4℃乳酸钠林格液，同时将大量冰屑敷于小肠上快速降温。灌注开始同时，紧贴肝门部剪断门静脉, 并将门静脉引入自制Cuff套管内，翻转静脉内膜于套管外并以50丝线结扎固定。灌注至肠系膜和肠壁血管床苍白，门静脉套管端流出液清亮时，在游离段两端处切断腹主动脉。同门静脉套管方法，将腹主动脉远心端引入Cuff套管，翻转内膜于套管外，两道50丝线结扎固定。把带有两个Cuff套管的移植肠置于4℃乳酸林格液中保存待用。

　　1.3.3 受体手术 切口与供体相同, 游离左肾及左肾血管。结扎左侧输尿管，近腹主动脉处结扎切断左肾动脉,将左肾翻上留置备用。游离肾下腹主动脉1.5～2.0cm左右。阻断腹主动脉游离段上、下两端,于游离段中下1/3处剪断，肝素生理盐水冲洗两端腹主动脉管腔。将上段腹主动脉断端按照供体门静脉套管方法套至Cuff套管上，两道50丝线结扎固定。用包有冰屑的纱布保护移植肠，置于腹主动脉旁。调整位置使供肠所带腹主动脉与受体腹主动脉断端解剖位置对应。以两根90无损伤线牵引受体腹主动脉下段断端，并以血管镊协助打开此管腔，将已套好Cuff套管的供肠腹主动脉远心端置入其中，两道50丝线结扎固定。同样方法将已套好Cuff套管的受体腹主动脉近心端置入供肠所带腹主动脉近心端管腔，双重丝线结扎固定。经左肾静脉缓慢注入温盐水1mL，血管夹于左肾静脉根部阻断左肾静脉，沿肾门处切除左肾。同法将供体带Cuff套管门静脉置入左肾静脉，丝线结扎固定(图1)。移除血管夹，可见移植肠迅速变为鲜红色，动脉搏动明显，静脉回流良好(图2)。迅速以37℃温盐水腹腔复温。切除约20cm回肠。将移植肠近、远端分别与受体近、远端肠吻合，70无损伤线全层连续缝合，浆肌层包埋。固定移植肠系膜，温盐水冲洗腹腔至清亮，关腹。

　　1.3.4 术后处理 受体关腹时多已清醒，术后即可自行翻身爬动。单笼饲养，白炽灯光照保暖。手术当日饲以50g/L糖盐水，次日起饲流食，3d后恢复正常饮食。术后不用免疫抑制剂。存活超过4d者视为手术成功。术后观察一般状况。

　　2 结 果

　　共进行移植30例，成功27例，多于术后5、7、14d处死取材，3例存活超过1月。失败3例：1例为麻醉过量致死，1例因游离血管不慎致低血容量性休克，1例死于腹腔感染。手术成功率90%。供体手术平均耗时(42±5)min，供肠修整耗时(3±1)min，受体手术耗时(65±10)min，热缺血0min，冷缺血(32±3)min，三次套管共耗时(10±1)min，总手术耗时(160±10)min。

　　3 讨 论

　　经典的大鼠小肠移植模型由NAKAO等[5]采用供肠肠系膜上动脉和受体腹主动脉端侧吻合、供肠门静脉和受体下腔静脉吻合完成血管重建。由于大鼠血管纤细，此方法需借助手术放大镜，需要较高的显微外科操作技术，术中术后并发症多，存活率较低。后来学者不断在血管重建方面做出改进，其中孙家乾等[6]提出了三袖套血管吻合法建立大鼠异位小肠移植模型。本文在其基础上，进一步改进血管重建技巧及部分手术过程。

　　3.1 最大程度保护供肠 供体开腹后即结扎髂总动脉平面以上之腹主动脉，以增加供肠血供，提高其对缺血的耐受能力;切除全结肠，为手术操作提供更大空间，保持供肠始终位于腹腔中，并以盐水纱布妥善保护;完成门静脉游离之前，暂不结扎脾静脉、胃幽门静脉，避免相关脏器淤血导致有效循环血量减少造成供肠损伤;原位灌注肠管时压力不宜过高，避免损伤小肠黏膜;灌注同时以大量冰屑使供肠快速降温，降低代谢，减轻缺血损伤;灌注效果需达到肠系膜和肠壁血管床苍白, 门静脉套管端流出液清亮，但灌注时间不宜过长，避免增加冷缺血时间;灌注过程中避免夹闭门静脉等操作，以免造成灌注压力过高;供肠切取与血管修整过程中以湿棉签接触供肠，尽量避免钳夹，减少翻动，使其少受机械性损伤。肠管吻合时选用70无损伤缝合线，线过细切割肠管，过粗易致狭窄;如发现肠管血运不佳时可切除不良肠管。

　　3.2 改良的三袖套法完成血管重建 自制的Cuff套管由经热水软化并1.5倍长拉伸处理的一次性静脉输液管制成,内径1.2mm，长约4mm，分为管体和管柄两部分，管体部分用手术刀片轻刻出数道环形划痕以防丝线结扎后滑动脱落，管柄部分为管壁剪除1/3周径制成，保留了2/3管径更有利于手术钳牢靠夹持套管。尽量游离供体腹主动脉达到3cm，可以保证套管后留有足够长度进行动脉重建。因为近心端在肠系膜上动脉之上常有粗大的腹腔干分出，且局部结构复杂，难以游离足够长的腹主动脉用于套管，所以近心端距肠系膜上动脉根部达到0.5～1.0cm即可，血管重建时作为受体腹主动脉套管置入的一方。远心端尽量向下游离，以保证套入Cuff管后留有足够长度置入受体动脉，这样可以缩短受体腹主动脉向远端游离的长度，减少结扎腰动脉分支，减轻受体下肢血运障碍的可能。受体游离段腹主动脉两端夹闭后避免从正中剪断，而是从中下1/3处剪断，下段用于接受供肠腹主动脉套管置入，上段先行套管，再置入供肠腹主动脉近心端。即便套管时动脉管壁因挂线、钳夹而撕扯不得不剪短撕扯部分，以上供、受体动脉长度及分段方法也能够避免动脉套管吻合过程中出现血管长度紧张的情况，而且实践证实，套管完成后腹主动脉长度适宜张力适度，并无折弯扭曲现象。动脉套管均以两道50丝线结扎以确保套管不脱落，且使管柄固定于动脉壁腹面，操作时方便正面钳夹管柄，有利于保持套管角度，避免血管扭转。套管吻合基本不发生漏血，只需经左肾静脉补液1mL以弥补手术野蒸发失液。静脉套管时同样注意套管角度，避免扭转造成静脉回流不畅。动静脉均采用Cuff套管，血管内膜相对合，管腔通畅，腔内无异物暴露，因此术中术后吻合口血栓形成发生率低，避免了传统血管吻合最常见的失败原因(漏血、狭窄、血栓形成等)[7]。

　　3.3 统筹供、受体手术过程 为缩短供肠冷缺血时间，统筹供、受体手术过程：供体完成血管游离后不立即进行灌注，盐水纱布覆盖腹腔后旁置待用，直至完成受体血管游离。其他步骤如前所述。这样安排可以有效减短供肠保存时间，减少缺血再灌注损伤，提高供肠质量。

　　3.4 不需手术放大镜 套管行血管重建只需目视下进行，摆脱了对手术放大镜的依赖，降低了对显微外科操作技术的要求，利于快速培养建模人员，缩短了建模周期，减少了预试验次数。

　　综上所述，严格注意各细节以保护供肠，采用改良的三袖套技术重建血管，统筹供受体手术过程，能够较为快捷地建立简便、成功率高、并发症少的大鼠节段性原位小肠移植模型，为小肠移植的实验研究奠定了基础。

　　【参考文献】

　　[1]RUIZ P, KATO T, TZAKIS A. Current status of transplantation of the small intestine [J]. Transplantation, 2007, 83:16.

　　[2]YANDZA T, SCHNEIDER SM, CANIONI D, et al. Intestinal transplantation [J]. Gastroenterol Clin Biol, 2007, 31(5):469479.

　　[3]KORT WJ, WESTBROECK DL, MACDICKWN I, et al. Orthotopic total small bowel transplantation in the rat [J]. Eur Surg Res, 1973, 5(2):8189.

　　[4]樊林，车向明，赵伟，等. 大鼠原位小肠移植模型的建立与改进 [J]. 中国普通外科杂志, 2006, 15(2):125128.

　　[5]NAKAO A, TAHARA K, INOUE S, et al. Combined cuff and suture technique for orthotopic whole intestinal transplantation in rats [J]. Microsurgery, 2002, 22:8590.

　　[6]孙家乾，李国新，黄祥成. 三袖套血管吻合法行大鼠异位小肠移植 [J]. 中华器官移植杂志, 2004, 25(9):276277.

　　[7]NAKAO A, MITSUOKA N, SHEN SD, et al. Rat small intestinal transplantation: A comparison of the cuff and hand suture methods [J]. Acta Med Okayama, 2000, 54(6):259264.