肝硬化大鼠肝脏组织病理学及血流动力学变化

　　作者：乔伟1,2，鲁建国1，王 青1，李鹏超1 作者单位：(1. 第四军医大学唐都医院普外科，陕西西安 710038;2. 西安市铁路中心医院普外科，陕西西安 710054)

　　【摘要】 目的 通过建立大鼠肝硬化模型，了解肝硬化形成过程中门静脉血流动力学的变化。方法 雄性健康SD大鼠100只随机等分为5组：4个实验组(80只，每组20只)采用腹腔及皮下注射四氯化碳(CCl4)，同时饮用酒精溶液进行诱导;对照组(20只)给予普通饮水和饲料。分别于2、4、7、10周后观察肝脏的组织病理学改变及门静脉血流动力学变化。结果 肝硬化过程中肝细胞经历变性、坏死、纤维组织增生及假小叶的形成;血流动力学检测指标发生相应变化，平均动脉压(MAP)表现为逐渐下降，门静脉压力(PVP)、下腔静脉压(IVCP)及门静脉阻力(PVR)表现为逐渐升高，门静脉血流量(PVF)表现为先升高后下降，内脏血管阻力(SVR)表现为先下降后升高。结论 本方法可建立稳定的肝硬化门脉高压症模型，且适于大批量制作;在大鼠肝硬化门脉高压形成过程中门静脉血流动力学及肝组织病理学均发生了变化，可用于肝硬化门脉高压症方面的相关研究。

　　【关键词】 肝硬化;门脉高压;组织病理学;血流动力学;大鼠

　　Histopathological and hemodynamic changes of rats with liver cirrhosisQIAO Wei1,2, LU Jianguo1, WANG Qing1, LI Pengchao1

　　(1. Department of General Surgery, Tangdu Hospital, Fourth Military

　　Medical University, Xian 710038; 2. Department of General Surgery,

　　Xian Railway Center Hospital, Xian 710054, China)ABSTRACT: Objective To investigate the hemodynamic changes during the progression of portal hypertension (PHT) by establishing a model of liver cirrhosis in rats. Methods Totally 100 healthy male SD rats were assigned to 5 groups randomly (1 control group and 4 experimental groups with 20 rats in each group). Animal model of cirrhosis was established by subcutaneous injection of carbon tetrachloride (CCl4) and drinking alcohol. Rats in control group were given water and forage. The changes in the portal hemodynamics during the pathological process of liver tissues were observed after 2, 4, 7 and 10 weeks. Results During the formation of experimental cirrhosis, the hepatocytes of rats underwent 4 processes: degeneration, necrosis, fibrosis and pseudolobular proliferation. The hemodynamic changes were observed: the mean arterial pressure declined gradually after injection, but the portal venous pressure, the inferior vena cava pressure and the portal vascular resistance increased slowly. The portal venous flow reduced after ascending whereas the splanchnic vascular resistance increased after descending. Conclusion This method can establish a stable cirrhosis PHT model, which can be made in large quantities. During the progression of PHT, there are significant changes in portal vein hemodynamics and pathology, which can be used in related research on PHT.

　　KEY WORDS: liver cirrhosis; portal hypertension; histopathology; hemodynamics; rat

　　肝硬化是一种常见的慢性进行性肝病，由一种或几种病因长期或反复作用引起，以肝功受损和门静脉高压为主要表现。在我国由乙肝引起的肝硬化门脉高压症远高于发达国家。在现代肝脏外科研究中，人们认识到门静脉系统具有特殊的解剖结构，并且在功能上有分区现象，而门静脉血流动力学的改变是门脉高压症的重要发病机制。血流动力学检测已成为评价门静脉高压症疗效的金标准[1]。在本实验中，我们通过大鼠腹腔及皮下注射四氯化碳(CCl4)加饮用酒精溶液[2]，建立肝硬化大鼠动物模型，动态、连续监测肝硬化大鼠形成过程中的血流动力学指标，研究其变化规律，为有关肝硬化门脉高压症的动物实验提供模型基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物及分组 雄性SD大鼠100只，清洁级，体重(240±20)g，购自第四军医大学实验动物中心。随机等分为5组：前4组为实验组(共80只)，分别于造模第2、4、7、10周进行相关指标检测;第5组为空白对照组(20只)，于第10周进行相关指标检测。

　　1.2 实验器材及试剂 995mL/L CCl4分析纯，乙醚，950、750mL/L医用酒精，肝素，大豆油，生理盐水。TD型电子天平(余姚市金诺天平有限公司)，显微外科手术器械，压力换能器，四道生理记录仪(NIHON KOHDEN, Japan)，MFV3200型电磁血液流量计(NIHON KOHDEN, Japan)。

　　1.3 实验准备 将995mL/L CCl4与大豆油配成400mL/L、600mL/L的CCl4油溶液，950mL/L医用酒精与饮用水配成100mL/L的酒精溶液。

　　1.4 肝硬化模型的建立 实验组大鼠前2周腹腔注射400mL/L CCl4油溶液，首次剂量按0.5mL/100g体重，以后按0.3mL/100g体重，每周2次，腹腔注射共4次;2周后改为600mL/L CCl4油溶液腹部皮下注射，按0.3mL/100g，每周2次，皮下注射共16次;同时给予100mL/L酒精溶液喂养，自由摄取普通颗粒饲料。对照组大鼠正常饮水及摄取普通颗粒饲料。成模时间预计为10周。

　　1.5 检测指标及方法 实验动物按照分组分别于第2、4、7、10周后进行血流动力学指标检测。乙醚开放麻醉后，作剑突下正中切口，仔细游离门静脉，电磁血流量计测量门静脉血流量(portal venous flow, PVF)。分别穿刺回结肠静脉、下腔静脉和腹主动脉，插入测压导管(导管内注入肝素生理盐水抗凝)，通过压力换能器与四道生理记录仪连接，分别测定门静脉压力(portal venous pressure, PVP)、下腔静脉压(inferior vena cava pressure, IVCP)和平均动脉压(mean arterial pressure, MAP)。门静脉阻力(portal vascular resistance, PVR)和内脏血管阻力(splanchnic vascular resistance, SVR)按如下公式计算：PVR=(PVP-IVCP)/PVF;SVR=(MAP-PVP)/PVF。检测完成后处死大鼠，取出肝组织做病理切片，HE染色了解病理变化情况。

　　1.6 统计学分析 采用SPSS 13.0统计包进行统计分析。MAP、PVP、IVCP、PVF和SVR的检测结果以均数±标准差(±s)表示，采用单因素方差分析， 多重比较采用LSDt检验;SVR检测结果以中位数(M)和四分位间距(QR)表示，采用KruskalWallis秩和检验，多重比较采用Nemenyi检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 大鼠的一般情况 实验组80只大鼠在诱导过程中精神萎靡，食欲不振，活动减少，对外界刺激反应迟钝，皮肤无光泽、体毛脱落，并且伴有体重增长缓慢;注射CCl4后共死亡13只，死亡原因为CCl4过量引起中毒所致。存活大鼠67只，存活率82.75%。对照组20只大鼠全部存活。

　　2.2 肝组织病理学改变 对照组大鼠肝组织细胞大小一致,细胞排列呈条索状,以中央静脉为中心呈放射状,肝窦无狭窄，小叶及汇管区无炎细胞浸润(图1A);注射CCl4 2周后，大鼠肝脏轻度肿胀,镜下肝细胞肿胀,汇管区周围轻度气球样变(图1B);注射CCl4 4周后大鼠肝脏充血、肿胀,镜下肝细胞肿胀,气球样变加剧,仍以汇管区周围较明显(图1C);7周后大鼠肝脏充血、肿胀进一步加重，镜下见部分肝细胞变性、坏死，坏死以小叶周围显著，汇管区少量炎症细胞浸润及纤维组织增生(图1D);10周后大鼠肝脏萎缩明显,表面呈结节状，镜下可见肝细胞增生，汇管区纤维增生明显,包绕肝细胞形成大小不一的假小叶(图1E)。

　　2.3 门静脉系统血流动力学改变 随着实验时间的延长，MAP变化表现为逐渐下降(P<0.05)，PVP表现为逐渐升高(P<0.05)，IVCP亦表现为逐渐升高，但组间差异无统计学意义(P>0.05)，PVF表现为先升高后下降(P<0.05)，SVR表现为迅速下降后稍有升高(P<0.05)，PVR表现为逐渐升高(P<0.05)。不同时期实验组与对照组比较，MAP、PVP、PVF、PVR及SVR差异有统计学意义(P<0.05)，而IVCP无显著性变化(P>0.05)。实验4周组与2周组相比，各指标差异均无统计学意义;7周组与4周组相比，MAP、PVP、PVF和PVR差异有统计学意义(P<0.05);10周组与7周组相比，PVR差异明显(P<0.05，表1)。表1 各组大鼠的血流动力学变化

　　3 讨 论

　　3.1 动物模型的建立及评价 CCl4是在建立实验动物肝纤维化和肝硬化模型(CM)中使用最为广泛的化学性肝毒物[35]。CCl4经肝微粒体细胞色素P450激活生成CCl3及Cl，攻击肝细胞膜的磷脂,引起脂质过氧化破坏膜性结构;CCl3还可与蛋白质形成共价键，损害线粒体，还原性辅酶A(NADH)与三磷酸腺苷(ATP)在肝内生成减少，脂肪酸氧化受到限制，影响三羧酸循环致肝细胞“窒息”死亡。低浓度的CCl4反复应用，使肝脏在损害修复再损害中最终形成肝硬化。CCl4诱导的动物肝纤维化在形态学、病理生理学的某些方面与人类肝硬化类似，如二者均有肝细胞坏死后的再生，肝硬化晚期纤维的浸润几乎不可逆;而且，CCl4诱导的大鼠肝纤维化模型具有造模简便、费用低廉、耗时短、病变特征稳定可靠的优点。所以，该模型被广泛应用于体内肝纤维化发生机制的研究和抗纤维化药物的筛选。酒精为酶诱导剂，可损害线粒体，增加肝细胞氧耗量，还可增强CCl4对肝细胞的毒性作用。因此，两者同时作用可促进肝硬化的形成[36]。多因素致动物肝硬化是目前最常用的造模方法。CHATAMRA采用的500mL/L CCl4、100mL/L酒精为主的多因素综合法，诱导建立大鼠肝硬化模型，诱导时间约12周，目前已成为一种标准的诱导方法。

　　在本研究中，实验组80只大鼠造模结束后，存活67只，死亡13只，死亡率16.25%，死亡原因为注射CCl4过量引起中毒及感染。实验结束时，按照成模标准,造模成功15只,成活率75%(15/20)。对照组20只全部存活。

　　3.2 门静脉系统血流动力学的变化及意义 在本次实验中，腹腔注射CCl4 2周后即出现明显的PVP、PVF和SVR增大，而MAP和PVR减小，与正常大鼠相比差异有统计学意义(P<0.05);此时病理变化表现为肝脏由于充血、肿胀压迫肝血窦，导致门静脉血液回流障碍，门静脉压力增高，内径增宽，镜下见小叶周围出现少量肝细胞脂肪变性,而并未产生典型的纤维组织增生及假小叶形成的病理改变。实验结果表明，在大鼠肝硬化的形成过程中，血流动力学改变早于肝脏产生典型的不可逆性病理改变。这就提示我们肝硬化具有早期诊断及早期治疗的可能性。实验4周组与2周组相比各指标均无明显差异，但肝组织病理学变化相对加重。7周组MAP、PVP、PVF、PVR与4周组相比均有统计学差异(P<0.05)，此时肝组织病理学变化进一步加重。CCl4注射10周后大鼠PVR与7周组比较有统计学差异(P<0.05)，此时肝组织已经出现了典型的肝硬化组织病理学改变。结果表明，在肝硬化的形成过程中，门静脉系统血流动力学发生了相应的变化。有研究表明，由于肝细胞变性、坏死，肝功能受损，内毒素产生增加，肝及肺等器官对血管活性物质如一氧化氮等的分泌增加或在肝脏的灭活降低，导致肝硬化大鼠存在高动力循环状态。这种高血液动力学改变表现为心输出量增加、心率加快、内脏血流量增加、 外周血管阻力和内脏血管阻力下降、平均动脉压低[7]。高动力循环状态可能是对血管扩张、有效循环血容量不足的一种反应。

　　在大鼠肝硬化模型的形成过程中，门静脉血液回流受阻是门脉高压形成的主要因素，影响着门静脉的血流动力学。这可以解释本实验中PVR在组间比较时多数差异明显的结果。该血流动力学特点可以为其他相关研究提供模型。

　　【参考文献】

　　[1]漆德芳，孟申，刘健. 肝硬化 [M]. 北京：科学技术出版社, 2000:210227.

　　[2]SIMEONOVA PP, GALLUCCI RM, HULDERMAN T, et al. The role of tumor necrosis factoralpha in liver toxicity, inflammation and fibrosis induced by carbon tetrachloride [J]. Toxicol Appl Pharmacol, 2001, 177(2):112120.

　　[3]王丽春，赵连三. 肝纤维化的实验动物模型 [J]. 中国实验动物学报, 2004, 12(4):246250.

　　[4]MIZUMOTO M, ARII S, FURUTANI M, et al. NO as an indicator of portal hemodynamics and the role of iNOS in increased NO production in CCl4 induced liver cirrhosis [J]. Surg Res, 1997, 70(2):124133.

　　[5]何航，华海婴，戈士文，等. 姜黄素对四氯化碳诱导大鼠肝纤维化的影响 [J]. 郑州大学学报：医学版, 2009, 44(5):986990.

　　[6]叶春华，刘浔阳. 四氯化碳综合法制备大鼠肝硬化模型医学临床研究 [J]. 医学临床研究, 2005, 22(5):619622.

　　[7]李鹏超，鲁建国，马庆久，等. 大鼠肝硬化形成过程中门静脉压力及血流动力学变化 [J].第四军医大学学报, 2007,28(5):404406.