Cyclopamine联合YH16对人胰腺癌BxPC3细胞的抑制作用

　　作者：徐复国1,2,3，马清涌1，郭 坤1，胡恒通1，张 珉1，沙焕臣1，宫晓光1 作者单位：(1. 西安交通大学医学院第一附属医院肝胆外科，陕西西安 710061;2. 山东省肥城市人民医院普外科，山东肥城 271600;3. 皖南医学院弋矶山医院普外科，安徽芜湖 241001)

　　【摘要】 目的 体外研究Hedgehog(HH)信号通路阻断剂Cyclopamine和抗血管生成剂YH16对胰腺癌细胞株BxPC3的抑制作用。方法 以Cyclopamine和YH16单独或联合干预BxPC3细胞，MTT法观察药物对肿瘤细胞生长的影响，流式细胞仪检测细胞凋亡，RTPCR法检测细胞凋亡相关蛋白Bcl2和Bax的表达情况。结果 Cyclopamine和YH16对BxPC3细胞均有明显的抑制作用，两者联合作用时抑制作用更强(P<0.05)。Cyclopamine和YH16均可诱导细胞凋亡，联合作用后细胞的凋亡率更高(P<0.05)。Cyclopamine和YH16均可下调Bcl2和上调Bax的表达，联合用药则下调Bcl2和上调Bax更明显(P<0.05)。结论 Cyclopamine和YH16能抑制BxPC3肿瘤细胞的增殖，诱导细胞凋亡，两者联合作用时抑瘤效果明显增加，其机制可能与调控凋亡相关蛋白Bcl2、Bax的表达有关。

　　【关键词】 Cyclopamine;YH16;胰腺癌;细胞增殖;细胞凋亡

　　Inhibitory effect of cyclopamine combined with YH16

　　on human pancreatic cancer cell line BxPC3XU Fuguo1, 2,3, MA Qingyong1, GUO Kun1, HU Hengtong1,

　　ZHANG Min1, SHA Huanchen1, GONG Xiaoguang1

　　(1. Department of Hepatobiliary Surgery, the First Affiliated Hospital, Medical School of

　　Xian Jiaotong University, Xian 710061; 2. Department of General Surgery,

　　the Peoples Hospital of Feicheng City, Feicheng 271600; 3. Department of

　　General Surgery, Yijishan Hospital of Wannan Medical College, Wuhu 241001, China)ABSTRACT:Objective To explore the inhibitory effect of Hedgehog signal pathway blocker cyclopamine combined with YH16 on human pancreatic cancer cell line BxPC3 in vitro. Methods BxPC3 cells were treated with cyclopamine, YH16 or a combination of the two drugs, respectively. The growth curves of cells in each group were obtained by MTT assay. The cell apoptosis was examined by AnnexinV/PI flow cytometry. We observed the effect of cyclopamine combined with YH16 on Bcl2 and Bax mRNA expressions detected by RTPCR. Results Cyclopamine and YH16 obviously suppressed the growth of BxPC3 cells in dose and timedependent manners. Cyclopamine combined with YH16 resulted in greater growth inhibition than used alone (P<0.05). Both cyclopamine and YH16 induced apoptosis of BxPC3 cells. Furthermore, a combination of the two drugs led to a higher apoptosis rate (P<0.05). Cyclopamine or YH16 alone downregulated Bcl2 expression and upregulated Bax expression at the mRNA level. The combination of the two drugs could enhance the inhibitory effect significantly (P<0.05). Conclusion Cyclopamine and YH16 can inhibit the proliferation of BxPC3 cells and lead to their apoptosis. Moreover, cycloppamine combined with YH16 increases the inhibitory effect, which might be related to the regulation of apoptosisrelated proteins Bcl2 and Bax.

　　KEY WORDS: Cyclopamine; YH16; pancreatic cancer; cell proliferation; apoptosis

　　Hedgehog(HH)信号通路是一个高度保守的调控胚胎发育的信号通路，参与了胰腺、胃、结肠等消化道肿瘤的发生[13]。Cyclopamine(环巴胺)是HH信号通路的特异性阻断剂，现已发现其具有抗肿瘤作用[45]。血管生成抑制剂是一类毒性低、抗药性低的抗肿瘤新药物，通过阻断为肿瘤生长提供氧气和营养物质的新生血管生成而抑制肿瘤生长[6]。血管靶向性药物YH16(重组人内皮抑素)是一种抗血管生成和抗肿瘤药物[7]。BxPC3细胞系来源于一低分化胰腺导管腺癌患者，其倍增时间为54h，具有转移潜能。实验研究表明，胰腺癌细胞株BxPC3的HH信号通路呈激活状态。本研究选择人胰腺癌细胞BxPC3作为研究对象，探讨Cyclopamine联合YH16对胰腺癌BxPC3细胞的抑制作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 人胰腺癌细胞株BxPC3由西安交通大学医学院病理学系王一理教授惠赠，YH16购自山东烟台麦得津生物工程公司，Cyclopamine购自德国WGK公司，RPMI1640培养基(含双抗)、2.5g/L胰蛋白酶(含EDTA)购自 GIBCO公司，AnnexinV/PI凋亡试剂盒购自CALTAC公司，Bcl2、Bax引物购自北京三博远志生物技术公司，RevertVidTM cDNA逆转录试剂盒购自FERMENTAS公司，2×Taq PCR MasterMix购自TIANGEN BIOTECH 公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞培养 胰腺癌细胞系BxPC3用含100mL/L新生小牛血清的RPMI1640培养液，在37℃、50mL/L CO2和一定湿度的培养箱中体外孵育，培养液中含青霉素100IU/mL、链霉素100mg/mL，细胞生长达汇合状态时，2.5g/L胰蛋白酶消化后传代。全部实验均采用指数生长期细胞，实验重复3遍。

　　1.2.2 MTT法检测细胞的生长情况 将对数生长期BxPC3细胞以5×103/mL密度接种于96孔培养板(Corning, NY 14831, USA)上，每孔200μL，每组设4个平行孔;将培养板放入CO2孵箱，在37℃、50mL/L CO2及饱和湿度条件下培养过夜，细胞贴壁后单用Cyclopamine (0.625、1.25、2.5μmol/L)、YH16(10、20、30μg/mL)及 联合Cyclopamine(1.25μmol/L)和YH16(10、20、30μg/mL)干预细胞，分别培养24、48、72h;每孔加入MTT溶液(5mg/mL)20μL，37℃继续培养5h，终止培养;小心吸弃孔内培养的上清液，每孔加入150μL DMSO，震荡10min使甲襸充分溶解;选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度值(A)，记录结果。细胞生长抑制率(%)=(1-实验组A/空白对照组A)×100%。

　　1.2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡 收集不同处理组细胞，PBS洗2次，调整细胞密度为5×106/mL，取100μL细胞悬液加入20μL Annexin ⅤFITC和5μL碘化丙锭(PI)，混匀，于暗室处孵育15min，上流式细胞仪检测。

　　1.2.4 RTPCR检测药物对Bcl2和Bax mRNA表达的影响 用Trizol试剂提取Cyclopamine和YH16干预BxPC3细胞后的总RNA，测定260/280nm的A值，计算RNA浓度。Bcl2的上游引物：5′CGAGTGGGATGCGGGAGATG3′,下游引物：5′CGGGATGCGGCTGGATGG3′;Bax的上游引物：5′ TCAGGATGCGTCCACCAAGAAG3′，下游引物：5′TGTGTCCACGGCGGCAATC3′;βactin的上游引物：5′ATCGTGCGTGACATTAAGGAGAAG3′，下游引物：5′AGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG3′。取RNA 2μL，用RT试剂盒合成cDNA链，再以逆转录反应液2μL作为模板，PCR试剂盒进行扩增。PCR反应条件为：预变性94℃ 3min，94℃ 30s，退火55℃ 45s，延伸72℃ 1min，共35个循环;72℃延伸10min终止反应。扩增产物用1.5g/L琼脂糖凝胶电泳，紫外凝胶成像系统摄影。

　　1.2.5 统计学分析 采用SPSS13.0统计软件行统计学分析。计量资料以±s表示，两组间连续变量比较用t检验，多组间连续变量比较用方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 Cyclopamine联合YH16对人胰腺癌BxPC3细胞生长的影响 细胞生长抑制率柱状图显示，单用Cyclopamine和YH16均有抑制BxPC3细胞生长的作用，而且在一定范围内，随着剂量的增加和作用时间的延长，抑制率逐渐升高(图1A、1B);联合用药组与单用Cyclopamine组和YH16组比较，抑制率明显升高(P<0.05)，并呈时间和剂量依赖性(图1C)。

　　2.2 Cyclopamine联合YH16对BxPC3细胞凋亡的影响 流式细胞仪检测分析，获得4个象限组成的细胞直方图，左下象限代表正常细胞(AnnexinV-/PI-)，右下象限代表早期凋亡细胞(AnnexinV+/PI-)，右上象限代表晚期凋亡和死亡细胞(AnnexinV+/PI+)，左上象限代表细胞收集过程中出现的损伤细胞(AnnexinV-/PI+)，见图2。

　　图1 Cyclopamine和YH16干预对BxPC3细胞生长的抑制作用

　　Fig.1 Inhibitory effects of Cyclopamine and YH16 on BxPC3 cell growth

　　A：Cyclopamine对BxPC3细胞增殖的影响;B：YH16对BxPC3细胞增殖的影响;C：Cyclopamine联合YH16对BxPC3细胞增殖的影响。与YH16组和Cyclopamine组相比，# P<0.05。

　　图2 Cyclopamine和YH16对BxPC3细胞凋亡的影响

　　Fig.2 Effects of Cyclopamine and YH16 on apoptosis of BxPC3 cells

　　A：对照组;B：Cyclopamine (1.25μmol/L);C:YH16 (20ng/L);D: Cyclopamine (1.25μmol/L)+YH16 (10ng/mL);E：Cyclopamine (1.25μmol/L)+YH16 (20ng/mL);F：Cyclopamine (1.25μmol/L)+YH16(30ng/mL)。 AnnexinⅤ/PI染色流式术检测显示，无药物作用的BxPC3细胞的凋亡率仅为(5.2±0.36)%，单用Cyclopamine和YH16作用于BxPC3细胞的细胞凋亡率分别为(10.2±0.75)%和(17.7±1.36)%，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);联合用药组细胞凋亡率明显升高，与对照组比较差异显著(P<0.05)，与单用药组比较差异亦有统计学意义(P<0.05)，且凋亡率与Cyclopamine和YH16有剂量依赖性关系，表现为两药的相加作用(图3)。

　　2.3 Cyclopamine联合YH16对BxPC3细胞Bcl2和Bax表达的影响 RTPCR检测显示，单用Cyclopamine和YH16均可下调Bcl2 mRNA的表达，上调Bax mRNA的表达，联合用药则可明显下调Bcl2 mRNA的表达及上调Bax mRNA的表达(图4)。表1为Cyclopamine和YH16对BxPC3细胞Bcl2 mRNA和Bax mRNA表达的灰度值比较。采用三因素析因设计资料的方差分析进行统计学分析，药物干预组分为Cyclopamine组、YH16组、联合用药组和对照组，3个作用时间点为24、48、72h。结果显示，Cyclopamine组、YH16组与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，联合用药组与单用组和对照组比较，差异亦有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。表1 BxPC3细胞Bcl2 mRNA和Bax mRNA表达的灰度值比较

　　3 讨 论

　　生物治疗逐渐成为胰腺癌综合治疗中的第4种模式。合理使用或联合使用能够阻断一种以上癌基因途径的药物，或将肿瘤分子靶向药物与放化疗联合使用是胰腺癌分子靶向治疗未来的研究方向之一。本实验探讨的是生物制剂联合用药对胰腺癌增殖和凋亡的作用及其可能的机制。目前国内外有关Cyclopamine联合YH16作用于胰腺癌的研究尚未见报道。Hedgehog信号通路异常激活同胰腺癌的发生密切相关。Cyclopamine是HH信号通路分子Smoothened(SMO)的特异性阻断剂，可以抑制由Sonic Hedgehog(SHH)信号引起的细胞反应，但它并不是一种全身性的化疗药物，对机体的其他部位不会产生副作用。Cyclopamine的抗肿瘤作用仍处于实验研究阶段[811]。YH16具有抗血管生成和抗肿瘤作用。实验研究和临床试验均显示，YH16结合化疗、放疗、生物治疗以及其他疗法被单用药物治疗具有更强的抑瘤作用[7,1213]。作为肿瘤血管靶向性药物，YH16可调控多种分子信号通路发挥抗肿瘤作用，并已进入临床Ⅳ期实验，但其确切的抗肿瘤作用机制仍需进一步探讨。有研究发现，胃腺癌SHH与VEGF表达存在正相关性[14]，这提示肿瘤HH信号通路分子SHH的表达能促进肿瘤组织微血管的生成。HH信号通路与肿瘤血管生成存在相关性为我们应用HH信号通路阻断剂为什么联合血管生成抑制剂抗胰腺癌治疗提供了理论上的可能性。我们的前期研究发现，胰腺癌细胞株BxPC3 HH信号通路主要分子呈阳性表达，表明BxPC3细胞的生长依赖于HH信号的激活，这为我们应用Cyclopamine联合YH16干预胰腺癌细胞株BxPC3会达到预期的协同抑瘤效果提供了可能性。因为不依赖于HH信号的胰腺癌细胞株对于HH信号阻断剂无明显抑瘤效果。

　　本研究结果显示，单用Cyclopamine和YH16均有抑制BxPC3细胞生长的作用，联合用药处理细胞可进一步增强对肿瘤细胞的抑制作用，其作用呈浓度依赖性和时间依赖性。Cyclopamine和YH16均可诱导BxPC3细胞凋亡，两者联合用药可使细胞凋亡率明显升高。其原因可能与凋亡关联的甲基化基因在去甲基化后被激活有关。Cyclopamine和YH16可通过促进抑制癌细胞生长和凋亡相关的蛋白质的合成，从而使细胞凋亡，抑制和杀伤了癌细胞。本实验显示的Cyclopamine联合YH16抗肿瘤的累加作用，原因可能是由于协同调控细胞凋亡相关蛋白Bcl2和Bax。细胞凋亡发生机制复杂，多个基因参与细胞凋亡的调控，其中Bcl2和Bax分别是经典的抑制凋亡基因和促进凋亡基因。Bcl2家族是一组控制凋亡过程的基因，Bcl2基因具有抗凋亡的作用。正常情况下，Bcl2呈周期性低水平的表达，过量表达的Bcl2可抑制细胞凋亡。Bax基因是Bcl2基因的同族成员，功能与Bcl2相反，能促进细胞凋亡。Bcl2与Bax之间的动态平衡是调节细胞正常凋亡的主要机制。目前，许多研究者还观察到Bcl2蛋白水平高低与胰腺肿瘤细胞对化疗的敏感性和耐药性有关。文献已经证明Cyclopamine和YH16均可通过调控Bcl2和Bax来发挥抗肿瘤的作用。本研究结果亦发现，Cyclopamine和YH16能下调胰腺癌Bcl2表达、上调Bax表达，从而使Bcl2/Bax比值下降，激活胰腺癌细胞的凋亡途径。这可能是其抗癌增效的作用机制之一。因此，联合用药显示了协同累加作用。

　　本实验的不足之处是仅选择了一种人胰腺癌细胞BxPC3作为研究对象，进一步研究尚需扩大不同的胰腺癌细胞株，比如SW1990、Patu8988s、PANC1、CFPAC、MiaPaCa2等。本研究的后续实验宜建立胰腺癌动物移植瘤模型进行体内实验，以进一步检测这两种抗癌性药物联合用药的敏感性。

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