硫化氢对大鼠肝星形细胞增殖和氧应激的影响

　　作者：王宏宾 樊海宁 邓 勇 作者单位：青海大学附属医院普外科

　　【摘要】 目的 探讨H2S对大鼠肝星形细胞(HSC)增殖和氧应激的影响。方法 用铁超载的方法复制HSC增殖模型，通过绘制生长曲线以及CCK-8细胞计数法检测不同浓度的H2S对500 μmol/L次氮基三乙酸铁(FeNTA)作用下的HSC增殖的影响。通过不同浓度的H2S作用于500 μmol/L FeNTA培养的HSC，检测6 h、12 h、24 h细胞上清液和裂解液中H2S、SOD活力、MDA含量，观察H2S对HSC氧应激反应的影响。结果 同对照组比较，一定浓度的H2S对HSC增殖有抑制作用。在FeNTA诱导的氧应激反应中，一定浓度范围的H2S可有效提高SOD的活性和降低MDA含量。 结论 H2S对HSC增殖有较强抑制作用，对FeNTA诱导的氧应激具有保护作用。

　　【关键词】 肝纤维化 肝星形细胞 硫化氢 氧化应激

　　EFFECTS OF HYDROGEN SULFIDE ON THE PROLIFERA

　　TION AND OXIDATIVE STRESS OF RAT HEPATIC

　　STELLATE CELLS IN VITRO

　　Wang Hongbin, Fan Haining, Deng Yong

　　Department of Surgery, the affiliated hospital of Qinghai University

　　Abstract Objective To investigate the effects of oxidative stress on the proliferation of rat hepatic stellate cells (HSC). Methods HSC were incubated with FeNTA. The effect of various concentrations of H2S on the proliferation of rat HSC incubated with 500 mol/L FeNTA were measured by making cell growth curves and CCK-8 counting. After rat HSC were incubated with various concentrations of H2S and FeNTA for 6h, 12h, and 24h, the activity of superoxide dismutase (SOD) and contents of H2S and malondialdehyde(MDA) in culture supernatant and cell lysis solution were detected to observe the effect of H2S on the oxidative stress of rat HSC. Results Compared with the control group, the proliferation of rat HSC was inhibited when the concentration of H2S in the medium reached to a certain range .In the oxidative stress induced by FeNTA, H2S within certain strength range, obviously enhanced the activity of SOD and decreased the contents of MDA in supernatants of rat HSC culture media. Conclusions H2S could inhibit the proliferation of rat HSC and it, within a certain strength range, exert protective effect in oxidative stress induced by FeNTA.

　　Key words Liver fibrosis Hepatic stellate cell Hydrogen sulfide Oxidative stress

　　硫化氢(H2S)是近年来发现的一种继CO、NO之后的第三种气体信号分子。内源性H2S由半胱氨酸在胱硫醚-β-合成酶(CBS)、胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)和半胱氨酸转移酶催化下产生，其1 /3以H2S气体形式存在，2 /3以硫氢化钠(NaHS)固体形式存在[1]。近年来人们逐渐发现H2S在神经功能调节、平滑肌舒张[2]、血管重构[3]、炎症反应及肝纤维化中有一定的作用。我们运用铁超载的方法激活HSC，在细胞水平复制氧应激肝纤维化模型并给予外源性H2S供体NaHS,通过测定HSC的生长曲线、氧化抗氧化指标和CSEmRNA的表达来探讨 H2S对HSC的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　大鼠肝星形细胞购自湖南长沙万百生物公司。DMEM培养基为Gibco 公司产品，二甲亚砜(DMSO)和硫氢化钠(NaHS)为美国Sigma公司产品，胎牛血清为杭州四季青生物工程材料研究所产品，超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)试剂盒为南京建成生物工程公司产品。CCK-8细胞计数试剂盒购自上海同仁化学研究所。

　　CO2培养箱(Thermo公司)，倒置相差显微镜(Nikon公司)，酶标仪、凝胶成像分析系统(Bio-Rad公司)，PXS-270离子计和敏感硫电极(上海雷磁公司)，PCR 扩增仪(Eppendorf公司)，枸橼酸铁胺(Ferric ammonium citrate)、次氮基三乙酸二钠(NTA)( Sigma-aldrich公司)。次氮基三乙酸铁(Ferric nitrilotriacetate, FeNTA): 将470 mgNTA溶于100 ml双蒸水，调整PH至2.0,将200 mg Ferric ammonium citrate加入该溶液彻底溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌，调整pH至7.0,使终浓度为10 mM。使用时稀释至500 μmol/L。

　　1.2 方法

　　1.2.1 实验分组及药物浓度梯度

　　空白组(B组)：HSC-T6

　　对照组(C组)：HSC-T6+500μmol/L FeNTA

　　NaHS组(N组)：

　　N1：HSC-T6+500μmol/L FeNTA+20μmol/L NaHS

　　N2：HSC-T6+500μmol/L FeNTA+100μmol/L NaHS

　　N3：HSC-T6+500μmol/L FeNTA+200μmol/L NaHS

　　1.2.2 细胞增殖实验

　　取对数生长期的HSC-T6以0.25%胰蛋白酶消化后制成单细胞悬液，调整细胞浓度(5×107/L)后接种于96孔培养板中，每孔加入100 μl细胞悬液，37℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养48 h，换用无血清DMEM培养基继续培养24 h，使细胞同步化。将细胞分为空白组(B组)、 对照组(C组)、NaHS组(N1、N2、N3组)，每组设3个复孔，弃去旧培养基，分别加入100 μl含相应试剂的DMEM培养基，分别在培养6 h、12 h、24 h后测定吸光光度值。以时间(6h、12h、24h)为横坐标，吸光度为纵坐标绘制生长曲线。

　　1.2.3 细胞上清液及裂解液上清液H2S测定

　　取对数生长期的HSC-T6以0.25%胰蛋白酶消化后制成单细胞悬液，调整细胞浓度(5×107/L)后接种于24孔培养板中，每孔加入2 ml细胞悬液，37℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养48 h，换用无血清DMEM培养基继续培养24 h，使细胞同步化。将细胞分为空白组(B组)、 对照组(C组)、NaHS组(N1、N2、N3组)，每组设3个复孔，分别加入含相应试剂的DMEM培养基，分别在孵育6 h、12 h、24 h后取培养上清液及裂解液上清液，将待测样品与抗氧化液按1:1混合，通过敏感硫电极法[4]测定样品S2-浓度，以标准S2-溶液测定值作标准曲线，以此间接反映H2S浓度。

　　1.2.4 细胞上清液中SOD活性和MDA含量测定

　　取对数生长期的HSC-T6以0.25%胰蛋白酶消化后制成单细胞悬液，调整细胞浓度(5×107/L)后接种于96孔培养板中，每孔加入200　μl细胞悬液，37℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养48　h，换用无血清DMEM培养基继续培养24　h，使细胞同步化。将细胞分为空白组(B组)、 对照组(C组)、NaHS组(N1、N2、N3组)，每组设3个复孔，弃去旧培养基，分别加入200　μl含相应试剂的DMEM培养基，分别在孵育6　h、12　h、24　h后取培养上清测定SOD浓度和MDA含量。步骤按试剂盒要求进行。

　　1.2.5 细胞裂解液中SOD活性测定

　　每孔加入1 ml PBS液，用刮刀刮下细胞，收集到离心管中，离心(4℃，2000 rpm)10 min，弃去上清液。向离心管内再次加入1 ml PBS液洗涤细胞，离心(4℃，2000 rpm)10 min，弃去上清液。加入1ml PBS悬浮细胞，置-20℃冰箱20 min,37℃水浴放置10 min,重复该步骤两遍。破碎细胞膜，加入PBS 1ml,离心(4℃，10000 rpm)15 min，取上清液用PBS液稀释，制成样品溶液，用SOD试剂盒检测细胞裂解液中的SOD活性。步骤按说明书进行。

　　1.2.6 胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)半定量RT-PCR测定

　　提取RNA，取出5 μl RNA溶液， 与1 μl琼脂糖凝胶电泳加样缓冲液(含0.25%溴酚兰，40%蔗糖)混合。上样于1%的琼脂糖凝胶(含有0.05μl/ml EB),120 V电泳15 min，紫外分析仪下观察，将符合条件的RNA置于-70℃冰箱保存备用。用无Rnase水对待测RNA样品做1：20稀释，充分混匀。用无Rnase水作为空白对照，在波长260 nm处调节紫外分光光度计读数至零，然后用紫外分光光度计分别测定样品260 nm、280 nm处的的OD值。OD260/OD280为1.8～2.0间的RNA用于后续实验。总RNA经鉴定，符合纯度和浓度要求后制备CDNA。引物设计根据NCBI核酸数据库公布的引物序列设计引物。

　　GAPDH: P1:ATGACTCTACCCACGGCAAG

　　P2:TACTCAGCACCAGCATCACC

　　CSE: P3:GTATTGAGGCACCAACAGGT

　　P4:GTTGGGTTTGTGGGTGTTTC

　　1.3 统计学处理方法

　　采用SPSS11.5软件进行统计分析。结果以x±S表示。显著性检验用单因素方差分析,两两比较用q检验，检验水准取α = 0.05。

　　2 结果

　　2.1 CCK-8增殖实验结果

　　无FeNTA干预的正常细胞组6 h和12 h之间无明显差异，但两者与24 h组均存在显著差异(P<0.05)。给予FeNTA后，6 h组促增殖作用不明显，12 h、24 h对照组与空白组相比均存在显著差异(P<0.05)。给予NaHS治疗后，12 h的N3组，24 h的各组与对照组相比，均有显著差异(P<0.05)。表1不同处理因素对HSC-T6增殖的影响 注： * B组内与 6h有差异，P<0.05 ;△与B组有差异，P<0.05; # 与C组有差异，P<0.05.

　　2.2 细胞培养上清液和裂解液中H2S的浓度测定结果

　　细胞培养上清液中H2S浓度：给予FeNTA后6 h, H2S浓度下降,随着时间的延长，对照组与空白组差异逐渐明显(P<0.05)。给予NaHS治疗后，与C组相比,除6 h N 1组外，其余各处理组均表现出6 h、12 h、24 h后H2S浓度显著提高(P<0.05)。

　　裂解液中H2S的浓度：给予FeNTA后H2S降低，对照组和空白组存在明显差异(P<0.05)。给予NaHS 12 h、24 h后N 1、N 2、N 3组与对照组相比均存在差异(P<0.05)，6 h时 N 1和N 2组与对照组相比差异不明显，N 3组与对照组存在显著差异(P<0.05)。N 1和N 2组，12 h、24 h差异不明显，但与6h相比均有显著差异(P<0.05)。N 3组，6 h、12 h、24 h之间均存在明显差异。

　　2.3 H2S对细胞上清液和细胞裂解液中SOD活性的影响结果

　　给予FeNTA( 500 μmol/L)有降低培养上清液中SOD活性的作用，在6 h、12 h、24 h对照组与空白组均有差异(P<0.05).给予NaHS后，12 h与24 h各组与对照组均有显著差异(P<0.05)。

　　给予FeNTA (500 μmol/L)能降低裂解液中SOD的活性，对照组在各时间点与空白组相比都存在明显差异(P<0.05)。给予NaHS 12 h、24 h各处理组与对照组相比均存在明显差异(P<0.05)。 表2H2S含量 注：上清液中：* 与B组有差异，P<0.05;△ 与C组有差异，P<0.05.

　　裂解液中：# 与B组有差异，P<0.05;○ 与C组有差异，P<0.05.表3SOD活性注：上清液中：* 与B组有差异，P<0.05;△ 与C组有差异，P<0.05.

　　裂解液中：# 与B组有差异，P<0.05;○与C组有差异，P<0.05.

　　2.4 H2S对细胞上清液中MDA含量的影响结果

　　给予FeNTA后，6 h、12 h对照组和空白组差异不明显，24 h后对照组和空白组相比有明显差异(P<0.05)。给予NaHS后6 h和12 h处理组与对照组相比均无明显差异，24 h N 2和N 3组与对照组相比均有明显差异(P<0.05)。各处理组随着时间的延长均有差异。

　　表4上清液MDA含量(nmol/ml，x±S)

　　组别6h12h24hB1.97±0.102.26±0.122.37±0.07C2.13±0.042.77±0.035.04±0.06*N12.11±0.012.73±0.044.83±0.18N22.08±0.022.62±0.03 4.46±0.08△N32.03±0.072.54±0.203.57±0.01△ 注：* 与B组对照有差异P<0.05;△ 与C组对照有差异P<0.05.

　　2.5 半定量RT-PCR法检测CSEmRNA凝胶成像系统分析结果

　　给予FeNTA后6h ，与B组相比CSEmRNA表达开始出现下调。随着时间的延长，差异逐渐显著(P<0.05)。给予NaHS后，CSEmRNA表达上调，6 h组与C组相比，差异不明显，12 h,24 h组与C组相比有显著差异(P<0.05)。表5CSEmRNA RT-PCR结果分析 注：* 与B组对照有差异P<0.05;△ 与C组对照有差异P<0.05.

　　2.6 H2S与MDA、SOD的相关关系

　　经Pearson相关分析发现，6 h组上清液H2S含量与MDA、SOD相关系数分别为-0.776、0.927(P<0.05)，12 h组上清液H2S含量与MDA、SOD相关系数分别为-0.727、0.881(P<0.05)，24 h上清液H2S含量与MDA、SOD相关系数分别为-0.867、0.980(P<0.05)，裂解液H2S与SOD 6 h、12 h、24 h组相关系数分别为0.927、0.965、0.885。说明H2S与SOD正相关，而与MDA负相关。相关系数的绝对值均>0.70，说明它们之间高度相关。 表6上清液、裂解液H2S含量与MDA、SOD相关系数 注：上述相关系数均有统计学意义，P<0.05.

　　3 讨论

　　肝纤维化的机制非常复杂。肝细胞的炎症、坏死、免疫反应、肝星形细胞的活化、脂质过氧化物的大量外溢都可以引起肝纤维化。TGF-β、PDGF等多种细胞因子均参与了这一过程。HSC的活化是肝纤维化发生的中心环节，各种致纤维化因素最终都会以HSC为靶标，最终激活HSC，通过效应的自我放大，使细胞外基质大量形成并沉积导致肝纤维化的发生。

　　铁沉积既直接激活HSC,又可以通过脂质过氧化反应导致HSC的间接激活。刘梅等应用不同浓度的次氮基三乙酸铁(FeNTA)培养大鼠肝星形细胞证实铁剂可以引起鼠肝星形细胞的增殖，导致氧化抗氧化失衡[5]。本实验通过给予FeNTA处理HSC-T6也发现了类似的现象，提示运用铁超载的方法制作肝纤维化模型可靠。

　　SOD是机体抗氧化损伤防御体系中最重要的抗氧化酶之一，反映了机体清除氧自由基的能力[6]。MDA是脂质过氧化的重要终产物之一，反映了机体细胞受自由基攻击的严重程度，可促进I 型胶原的mRNA表达。与HSC增殖和胶原合成密切相关[7]。

　　通过本实验，我们发现FeNTA造成的氧应激可明显升高MDA含量，而细胞上清液中和细胞裂解液中SOD活性明显降低，呈现出一定剂量依从关系。这与刘梅等的研究结果相同[6]。

　　硫化氢是一种气态信号分子，催化它产生的酶主要有CBS、CSE和半胱氨酸转移酶。CSE主要在主动脉、肺动脉、门静脉表达，CBS主要在神经系统内表达。在低氧性肺动脉高压中，H2S含量下降，给予外源性H2S可以缓解肺动脉压力的升高。在肺动脉高压发生中，CSEmRNA表达下调，H2S生成减少，提示H2S可能参与了肺动脉高压的发病过程。 Stefano Fiorucci通过研究H2S在正常和肝硬化大鼠肝组织中的作用发现，H2S是一种具有舒血管效应的气态信号分子，HSC的激活能够下调CSEmRNA的表达，从而减少H2S的产量，H2S含量的减少促进了门脉高压的形成，加快了肝纤维化的进程，形成恶性循环[8]。本实验通过铁超载促进HSC增殖复制肝纤维化模型时发现在激活的HSC中，CSE表达下调，H2S含量减少。给予外源性H2S供体NaHS能够上调CSE水平，增加H2S含量，缓解HSC增殖。提示H2S能够在一定范围内抑制HSC的增殖，减少氧化损伤，提高抗氧化能力，对肝纤维化具有一定的保护作用。

　　【参考文献】

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　　[7] Apte M. Oxidative stress :does it ‘initiate’hepatic stellate cell activation or only ‘perpetuate’the process? [J].Gastroenterol Hepatol，2002,17:1045-1048

　　[8] Fiorucci S，Antonelli E，Mencarelli A，et al. The third gas：H2S regulates perfusion pressure in both the isolated and perfusednormal rat liver and in cirrhosis [J].Hepatology，2005，42(3)：539- 548