硫化氢在大鼠肝星状细胞氧应激中的作用

　　作者：王聪 邓勇 秦伟 阳丹才让 谭大勇 刘懿芷 董晋 樊海宁 作者单位：1.青海大学医学院;2.青海大学附属医院普外二科

　　【摘要】 目的 利用铁超载的方法在体外复制肝纤维化的氧应激模型，给予H2S供体硫氢化钠(NaHS)和内源性H2S作用的KATP通道阻滞剂格列苯脲(GLBN)，论证氧应激下硫化氢对HSC细胞具有保护作用的假说。方法 将HSC-T6分为8组：空白组、对照组、NaHS组(分为3个浓度组)、格列苯脲组(分为3个浓度组)。用CCK-8试剂盒测定HSC细胞增殖情况;用MDA试剂盒测定上清液MDA(丙二醛)含量;用SOD(超氧化物歧化酶)试剂盒测定上清液和裂解液中SOD活力;用RT-PCR试剂盒检测p38基因表达水平。结果 1.Fe-NTA能够促进HSC的增殖，使p38基因表达水平降低、SOD活性降低、MDA浓度提高。对照组和空白组有明显差异(P<0.05);2.给予NaHS处理后，细胞增殖减慢，上清液中MDA含量下降，上清液、裂解液中SOD活性提高，p38基因表达水平增高(P<0.05);3.给予GLBN处理后，各项指标结果与给予NaHS处理后结果相对应，各组与对照组比较均有明显差异(P<0.05)。结论 氧应激下硫化氢对HSC细胞具有保护作用，可抑制肝纤维化的发生发展。

　　【关键词】 肝纤维化 肝星状细胞 硫化氢 硫氢化钠

　　A ROLE OF HYDROGEN SULFIDE ON OXIDATIVE STRESS

　　IN RAT HEPATIC STELLATE CELLS

　　Wang cong1, Deng Yong2, Qin Wei 2Yang Dan Cai Rang2,

　　Tan Da Yong 1,Liu Yi Zhi1,Dong Jin1，Fan Hai ning2

　　1.Medical College of Qinghai University;

　　2. The second department of General Surgery of the affiliated hospital of Qinghai University

　　Abstract Objective In order to investigate the changes and role of H2S in hepatic fibrosis, we make a oxidative stress model by incubating rat hepatic stellate cells with ferric nitri-lotriacetic acid(Fe-NTa) and analyzing the effects of Fe-NTA, sodium hydrosulfide(NaHS，H2S donor) and GLBN(a inhibitor of KATP channel through which H2S reacts). Methods HSC-T6 were divided into eight groups: Blank group， Control group， NaHS groups(to separate three groups);GLBN groups(to separate three groups). The MDA contents in culture supernatant and the SOD activity in culture supernatant and Cell Lysis Solution were detected .The HSC growth curve was detected by CCK-8 and the expression of p38 was detected by RT-PCR. Results 1. In comparison with that in the blank group, the proliferations of hepatic stellate cells with Fe-NTA interference were remarkably increased，SOD activity reduced. P38 expression was down regulated， MDA contents were increased significantly between control group and blank group (P<0.05). 2. After HSC treated with NaHS, the proliferation of HSC reduced, MDA contents reduced, SOD activity increased,p38 expressions increased , After HSC treated with GLBN, the effects are opposite to the effects in groups which HSC treated with NaHS. All the changes are significant as compared with that in the control group(P<0.05). Conclusion H2S may be an antioxidant, which can protect liver and inhibit the development of Hepatic fibrosis.

　　Key words Hepatic fibrosis Hepatic stellate cells Hydrogen sulfide Sodium hydrosulfide

　　肝纤维化源于肝脏纤维组织过度沉积，是肝脏纤维组织增生和分解失衡的结果。肝纤维化的机制非常复杂。肝细胞的炎症与坏死，免疫反应，肝星状细胞的活化，脂质过氧化物的大量外溢，TGF-β、PDGF等多种细胞因子，均参与了这一过程。肝星状细胞HSC的增生激活是肝纤维化发生的中心环节[1]，各种致纤维化因素最终都会以HSC为靶标，通过激活HSC使细胞外基质大量形成并沉积导致肝纤维化的发生[2]。

　　氧化应激和脂质过氧化与肝纤维化形成的关系密切，氧化和抗氧化损伤的失衡可以促进HSC的增值，导致胶原合成增加。MDA是脂质过氧化的重要中间产物，能够反应氧化损伤程度，MDA的累积可以通过多种途径激活HSC。SOD作为机体重要的抗氧化酶反映机体清除氧自由基的能力。

　　为了研究硫化氢在肝纤维化发生中的地位和作用,我们运用铁超载的方法激活HSC[3]，在细胞水平复制氧应激肝纤维化模型，给予外源性H2S供体NaHS和H2S作用的KATP阻滞药物格列苯脲,通过测定HSC细胞增殖情况、氧化抗氧化指标、p38的表达水平探讨H2S对HSC的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　人肝星状细胞株(HSC-T6)购自湖南湘雅细胞基因库;胎牛血清为杭州四季青生物工程公司产品;DMEM(高糖)为美国Gibco产品;CCK-8试剂盒购于日本同仁化学研究所;SOD试剂盒、MDA试剂盒均购自南京建成生物工程研究所;次氮基乙酸二钠(Na2NAC)、二甲基亚枫(DMSO)均购自美国sigma公司; RT-PCR 试剂盒购于MBI公司;Trizol为Invitrogen公司产品。

　　1.2 方法

　　1.2.1 体外细胞培养

　　肝星状细胞株(HSC-T6)，用含15%灭活的胎牛血清、100 μg/ml青霉素、100μg/ml链霉素的DMEM培养液，置于37℃、5%　CO2培养箱内培养，每2～3天传代一次;取对数生长期的HSC，用2.5 g/L胰酶消化后，以含150mL/L胎牛血清的DMEM配成细胞悬液，接种于96孔或24孔培养板，密度为5×107/L,每孔加入DMEM培养液100μL，置于37℃，50 mL/LCO2培养箱中培养过夜。24 h后细胞贴壁良好，换用含2mL/L胎牛血清的DMEM培养，使其生长同步化，再培养24h后加入Fe-NTA产生氧应激。

　　1.2.2 实验分组

　　将HSC-T6分为8组：空白组(B组，HSC-T6); 对照组(C组，B组+500μmol/L Fe-NTA);NaHS组(N1: C组+20 μmol/LNaHS;N2: C组+100μmol/LNaSH; N3: C组+200μmol/L NaHS);格列苯脲组 (G1: C组+20μmol/LGLBN; G2: C组+200μmol/L GLBN;G3: C组+700μmol/L GLBN)。

　　1.2.3 测定方法

　　设置6 h、12 h、24 h三个时间点，用CCK-8法测定HSC生长曲线，用MDA试剂盒测定上清液MDA含量，SOD试剂盒测定上清液和裂解液SOD活力，RT-PCR试剂盒检测p38基因表达水平。

　　1.2.4 PCR引物设计与合成

　　p38引物根据文献[8]方法由上海Invitrogen公司合成。具体引物序列见表1。

　　1.2.5 RT-PCR

　　Trizol一步法提取细胞总RNA,以TAKARA公司的Random Premier 为引物进行逆转录反应(以试剂盒说明书进行)。p38 PCR的反应条件为：预变性95℃ 5 min ，变性95℃ 30 s， 退火56℃ 45 s，延伸55℃ 50 s 共28个循环，延伸72℃ 5 min。行2%琼脂糖凝胶电泳。

　　1.3 统计方法

　　计量资料以x±S表示，用SPSS11.5软件进行统计分析。组间差异用单因素方差分析(one-way ANOVA),有显著差异者用Student-Newmen-Kuels q检验进行两两比较。检验水准取α = 0.05。

　　表1 引物序列

　　Table 1Primer Sequence

　　GeneSequenceproductAnnealingsize (bp) temperature(℃)p385’-TTCTCCGAGGTCTAAAGT-3’62956℃5’-ATCATAGGTCAGGCTTTT-3

　　2 结果

　　2.1 CCK-8测定细胞增殖情况

　　无Fe-NTA干预的正常细胞组6h和12 h之间无明显差异，但两者与24 h组均存在显著差异(P<0.05)。给予Fe-NTA后，6 h促增值作用不明显，12 h、24 h对照组与空白组相比均存在显著差异(P<0.05)。给予NaHS治疗后，12 h的N3组、24 h的各组与对照组相比，均有显著差异(P<0.05)。给予格列苯脲(GLBN)后，除6 h G1组、24 h G1、G2组外，其余各组在相应时间点与对照组相比有差异(P<0.05)。详细结果见表2(实验细胞每孔密度为5×107/L，每一个组设三个复孔即n=3)。 表2不同处理因素对HSC-T6增殖的影响 与对照组比较 ***P<0.05, 与对照组比较 **△△P<0.05.

　　2.2 上清液中MDA含量情况

　　给予Fe-NTA后，6 h组和12 h组、对照组和空白组对比差异不明显，24 h后对照组和空白组有明显差异(P<0.05)。给予NaHS后6 h和12 h处理组与对照组均无明显差异，24 h N2和N3组与对照组对比均有明显差异(P<0.05)。给予GLBN治疗后6 h和24 h的G2、G3组、12h的G3组与对照组对比均有明显差异(P<0.05)。各处理组随着时间的延长除G1组在6 h、12 h差异不明显外，其余各时间组均有差异(P<0.05)。详细结果见表3(实验细胞每孔密度为5×107/L，每一个组设三个复孔即n=3)。表3 上清液中MDA含量注：与空白组比较*P<0.05, 与对照组比较**P<0.05，与对照组比较***P<0.05.

　　2.3 上清液中SOD活力情况

　　给予Fe-NTA有降低培养上清液中SOD活性的作用，在6 h、12 h、24 h对照组与空白组对比均有差异(P<0.05)。给予NaHS后，12 h与24 h各组与对照组对比均有显著差异(P<0.05)。给予GLBN后，6h与12h的G2、G3组，24 h的各处理组均与对照组在相同时间点均存在差异(P<0.05)。各处理组除N3组在12 h、24 h外，G2组在6 h、12 h之间的差异不明显外，其余各组在各时间点均有差异(P<0.05)。详细结果见表4(实验细胞每孔密度为5×107/L，每一个组设三个复孔即n=3)。表4 上清液中SOD活力 注：与空白组比较*P<0.05 ,与对照组比较**P<0.05,与对照组比较***P<0.05.

　　2.4 裂解液中SOD活力情况

　　给予Fe-NTA能降低裂解液中SOD的活性，对照组在各时间点与空白组相比都存在明显差异(P<0.05)。给予NaHS 12 h、24 h各处理组与对照组相比均存在明显差异(P<0.05)。给予GLBN后，G3组在24 h与对照组相比差异明显(P<0.05)。详细结果见表5(实验细胞每孔密度为5×107/L，每一个组设三个复孔即n=3)。表5 裂解液中SOD活力注：与空白组比较*P<0.05,与对照组比较**P<0.05,与对照组比较***P<0.05.

　　2.5 半定量RT-PCR法检测细胞p38基因表达结果(见下图)

　　凝胶成像系统分析结果：给予Fe-NTA后6h ，与空白组相比p38表达出现下调。随着时间的延长，差异逐渐显著(P<0.05)。给予NaHS后，p38表达上调，6 h 时与对照组相比，差异不明显，12 h、24 h时与对照组相比有显著差异(P<0.05)。给予GLBN后，p38 在6h时就出现表达下调，与对照组相比有显著差异(P<0.05)，随着时间的延长，差异逐渐显著。

　　3 讨论

　　HSC的活化是肝纤维化发生的中心环节[4]，无论是那一种病因引起的肝纤维化最终都会激活HSC，通过效应的自我放大导致肝纤维化的发生发展。因此抑制它的活化是肝纤维化治疗中的重点。

　　铁沉积既可以直接激活HSC,又可以通过脂质过氧化反应导致HSC的间接激活。刘梅等应用不同浓度的次氮基三乙酸铁(Fe-NTA)培养大鼠肝星形细胞证实铁剂可以引起鼠肝星形细胞的增值，导致氧化抗氧化失衡[5]。本实验通过给予Fe-NTA处理HSC-T6也发现了类似的现象，这一现象提示：运用铁超载来促进HSC增值是一种可靠的肝纤维化造模方法。

　　氧化应激与肝纤维化形成关系密切,各种因素造成的肝损伤产生了大量的脂质过氧化物，超出了机体的清除能力，使其发生脂质过氧化、MDA水平提高、SOD含量减少。脂质过氧化产物损伤Kuppfer细胞、肝细胞，引起变性坏死，使氧自由基以及各种细胞因子大量释放，致HSC被激活。本实验通过研究发现HSC增值后，MDA水平提高，SOD活力下降，提示激活的HSC存在脂质过氧化损伤。Fiorucci实验证实给大鼠注射去甲肾上腺素(norepinephrine，NE)后发现门静脉压呈剂量依赖性增高，但这种效应在经NaHS治疗过的老鼠身上被部分消除，提示H2S在维持门静脉压方面有重要作用;H2S对肝微循环舒张功能的调节，说明H2S可以通过KATP通道途径使血管舒张，在此过程中KATP起到了主要作用[6] ,这个KATP通道可以被GLBN减弱。给予GLBN后，MDA进一步升高，SOD继续下降，过氧化损伤加重。给予外源性H2S后，能够降低MDA的同时提升SOD的活力，通过纠正氧化抗氧化失衡，对机体起到一定的保护作用。

　　人们研究证实的数条信号通路中，丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases , MAPK)参与细胞的生长、发育、分裂及细胞间的功能同步等多种生理功能过程，在肝纤维化中也是细胞信号传导的热点领域。MAPK是一蛋白激酶家族，包括细胞外信号调节激酶( ERK1/2) 、C-JUN 氨基端激酶(JNK) 、p38 丝裂原活化蛋白激酶( p38)等，MAPK 是多种信号的交汇点或共同通路，可将胞外刺激信号传递给胞核, 当MAPK激活后可能停留在胞质中,激活一系列其他蛋白激酶,同时也可能进入细胞核，通过磷酸化转录因子而调控基因的表达，MAPK的磷酸化在肝星状细胞的活化和增殖过程中发挥重要调控作用，进一步影响肝纤维化的形成和逆转[7]。本实验通过铁超载促进HSC增殖复制肝纤维化模型也发现激活的HSC中H2S含量减少、p38表达下调。给予外源性硫化氢供体硫氢化钠能够增加H2S含量，使p38表达上调，缓解HSC增殖。给予GLBN后H2S含量进一步下降，p38表达进一步下调，HSC增殖加剧。

　　动物实验证实H2S能够缓解门脉高压的形成[8]，对肝纤维化大鼠具有一定的保护作用。本研究通过铁超载的方法复制出肝纤维化模型，给予升高和降低H2S两种处理方式，结果提示H2S能够在一定范围内抑制HSC的增值，减少氧化损伤，提高抗氧化能力，对肝纤维化具有一定的保护作用。

　　【参考文献】

　　[1] Friedman SL. The cellular basis of hepatic fibrosis. Mechanisms and treatment strategies[J]. N Engl J Med , 1993, 328 (25) : 1828-1835

　　[2] Senoo H , Hata RI , Nagai Y. Stellate cells (vitamin A-storing cells) are the primary site of collagen synthesis in nonparenchymal cells in the liver[J]. Biomed Res , 1984 ，5 (6) : 451-458

　　[3] MacDonald RJ , Swift GH ,Quinto , et al . Primary structure of two distinct rat pancreatic preproelastase determined by sequence analysis of the complete cloned messenger ribonuleic acid and sequences[J]. Biochemistry , 1982 , 21 : 1453-1463

　　[4] Reeves HL, Friedman SL. Activation of hepatic stellate cells-a key issue in liver fibrosis[J]. Front Biosci,2002,7:808-826

　　[5]刘梅，陆伦根，陈尉华，等.氧应激对大鼠肝星状细胞增值的影响及还原型谷胱甘肽的抗氧化作用[J].世界华人消化杂志,2006，14(26)：2596-2600

　　[6]Fiorucci S，Antonelli E，Mencarelli A，et al. The third gas: H2S regulates perfusion pressure in both the isolated and perfused normal rat liver and in cirrhosis [J].Hepatology JT,2005,42(3): 539-548

　　[7]. Yang G, Cao K. Cystathionine gamma-lyase overexpression inhibits cell proliferation via a H2S-dependent modulation of ERK1/2 phosphorylation and p21Cip/WAK-1[J ]. Biol Chem，2004，279(47): 49199–49205

　　[8]Zhang Jiaping, Ying Xi,Chen Yu, et al. Construction,expression of TAT-p38ɑG and its capability of transduction into endothelial cells in vitro [J] .第三军医大学学报，2008，30(1)：15-18