IL1基因多态性与胃腺癌发生的关系

　　作者：邢培祥 曾庆东 高卫 汪运山

　　【摘要】目的：探讨白介素1B(IL1B)和白细胞介素1RN(IL1RN)基因多态性与胃腺癌及幽门螺杆菌(Hp)感染胃腺癌发生发展的相关性。方法：采用基因芯片技术检测130例胃腺癌患者和142例健康对照人群中IL1B31C/T、511C/T位点单核苷酸多态性(SNP);以琼脂糖凝胶电泳检测IL1RN基因多态性(VNTR)，同时应用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定了其血清中HPIgG/IgM/IgA型抗体浓度。结果：感染Hp阳性率胃腺癌明显高于对照组(P=0.007，OR=2.53)。IL1B31TT频率，胃腺癌组明显高于对照组(P<0.05，OR=2.16)，在低分化胃腺癌组明显高于高分化胃腺癌组(P<0.05，OR=6.55)。IL1B511TT基因型频率在胃腺癌组明显高于对照组(P<0.05，OR=1.81);在Hp阳性胃腺癌组511TT基因型及T等位基因频率明显高于Hp阴性胃腺癌(P<0.05，OR=2.25及P<0.05，OR=1.78)。胃腺癌组TT单体型频率显著高于对照组(χ2=4.56，P<0.05)。未见IL1RN基因及IL1B其他位点的SNP与胃腺癌组或Hp阳性胃腺癌组有显著相关性。结论：IL1B31TT基因型与胃腺癌特别是低分化胃腺癌易感性相关，IL1B511TT基因型与胃腺癌或感染Hp的胃腺癌易感性相关。TT单体型可能是胃腺癌的遗传易感因素。

　　【关键词】胃肿瘤?白细胞介素1?螺杆菌，幽门?多态性，单核苷酸

　　Relationship between IL1 gene polymorphisns and gastric adenocarcinoma

　　XING Peixiang1,ZENG Qingdong2,GAO Wei3,WANG Yunshan4

　　1Department of Clinical Laboratory,2Department of General Surgery,Qilu Hospital of Shandong University(Jinan 250012,China)

　　3Department of Oncology, 4 Department of Central Laboratory of Jinan Central Hospital, School of Clinical Medicine of Shandong University(Jinan 250013,China)

　　【ABSTRACT】Objective:To investigate relationships between the single nucleotide polymorphisms(SNPs) of interleukin1B(IL1B) and variable number of tandem repeat (VNTR)of interleukin1RN(IL1RN) promoter genes and susceptibility of the patients with gastric adenocarcinoma or the patients with gastric adenocarcinoma to helicobacter pylori (Hp) infection.Methods:

　　The SNPs of the IL1B(31C/T and 511C/T) were determined by gene chip and The VNTR of IL1RN were determined by agrose gel electrophoresis with a total of 130 cases of gastric adenocarcinoma and 142 healthy controls.The sera concentrations of IgG,IgM and IgA of Hp antibodies were measured by ELISA in all cases and controls.Results:H.pylori infection was detected in 69.2% of 130 patients and 46.5% of 142 controls (P=0.007,odds ratio [OR]=2.53).Frequencies of IL1B31TT genotype in patients with gastric adenocarcinoma or in patients with poolydifferentiated gastric adenocarcinoma were significantly higher than those in healthy controls or in welldifferentiated groups,(P<0.05;OR=2.16 and P<0.05;OR=6.55,respectively).Frequencies of IL1B511TT genotype in patients with gastric adenocarcinoma or with gastric adenocarcinoma with Hp infection were significantly higher than those in healthy controls or than that in HP negative group correspondingly (P<0.05;OR=1.81 and P<0.05,OR=2.55,respectively).T allele in patients with gastric adenocarcinoma with HP infection were significantly higher than that in HP negative group (P<0.05;OR=1.81 and P<0.05,OR=2.55,respectively).T allele in patients with gastric adenocarcinoma with HP infection were significantly higher than that in HP negative group (P<0.05,OR=1.78).Haplotype Frequencies TT in patients with gastric adenocarcinoma were significantly higher than that in healthy controls (χ2=4.25,P<0.05).No association was found between any of the other polymorphisms and patients with gastric adenocarcinoma or patients with gastric adenocarcinoma with HP infection.Conclusion:IL1B31TT genotype was significantly related to patients with gastric adenocarcinoma or patients with poolydifferentiated gastric adenocarcinoma.IL1B511TT genotype were significantly related to patients with gastric adenocarcinoma or patients with gastric adenocarcinoma with HP infection.The haplotype TT may be the genetic susceptible factor to gastric cancer.

　　【KEY WORDS】Stomach neoplasms?Interleukin1?Helicobacter,pylori?Polymorphism,single nucleotide

　　胃癌发生发展是多因素多阶段多基因参与的过程，其中，幽门螺杆菌(helicobacter pylori,HP)感染和遗传因素在胃癌发生发展中的作用备受关注[1，2]。IL1β是一种强力前炎症细胞因子，具有强大的抑制胃酸分泌的作用，在产生及放大幽门螺杆菌的炎症反应上起重要作用[3，4]。IL1ra是抗炎性细胞因子，能与IL1竞争性结合IL1受体，从而有效调控IL1的破坏作用[5]，如果这些分子出现了基因变异就会增加发生胃癌的危险性[6~9]，为此，我们对济南地区IL1β启动子区单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)及IL1RN数目可变的串联重复(variable number of tandem repeat VNTR)与胃腺癌易感性的关系进行了研究，现报告如下。

　　1资料与方法

　　1.1一般资料胃癌组：130例胃腺癌来自山东大学齐鲁医院、山东大学临床医学院济南南市中心医院肿瘤科及普外科2004年07月~2005年10月间住院病例。其中男70例，女60例，平均年龄(56.4±12.5)岁。分为淋巴结转移48例，无淋巴结转移82例;低、中、高分化胃腺癌分别为78、32、20例，均经病理切片证实。对照组：142例健康对照来自山东大学齐鲁医院健康查体中心，其中男70例，女72例，平均年龄(54.7±10.2)岁。所有对照均无自身免疫病、消化及其它系统疾病，无慢性炎症、无近期输血史。两组病例均来自济南近周地区汉族。样本符合遗传平衡定律。病例与对照均采集4ml EDTA抗凝血，分离部分血浆备测HP抗体，剩余部分颠倒混匀备抽提基因组DNA。标本80℃保存备用。

　　1.2试剂与仪器白细胞介素1B/1RN基因多态性检测芯片试剂盒由济南市中心医院中心实验室提供。白细胞介素1B试剂盒组成：提取液1、提取液2、预杂交液、杂交缓冲液、洗液1、洗液2、洗液3、抗体液、显色液、Taq酶、A和B扩增液、阴性扩增液、阴性对照液、阳性扩增液、阳性对照液组成。Hp抗体(IgG、IgM、IgA)检测试剂盒由美国Biochech,Inc提供。聚合酶链式反应(polymorase chain reaction,PCR)采用ABI公司生产的5700型PCR扩增仪。芯片检测采用Baio BE系列基因芯片检测仪(上海百傲科技有限公司)。PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，引物序列：IL1B31上游5’agaagcttccaccaatactc 3’，下游5’agcacctagttgtaaggaag 3’;IL1B511上游5’gcctgaaccctgcataccgt 3’，下游5’gccaatagccctccctgtct 3’;IL1RN上游5’cccctcagcaacactcc 3’，下游5’ggtcagaagggcagaga 3’。

　　1.3 方法

　　1.3.1 IL1B基因芯片分型：操作严格按说明进行。简略方法如下：①DNA抽提;②PCR扩增，94℃5min,94℃25s,56℃25s,72℃25s，40个循环，72℃延伸5min。扩增产物98℃变性5min。迅速放入冰盒，-20℃放置备用;③杂交：基因芯片置杂交舱中加入200μl预杂交液，41℃5min，然后加入已变性的PCR扩增产物和200μl杂交液，41℃30min;再加入200μl已预热的1号洗涤液，41℃5min,重复两次;④显色：向杂交舱中加入2号洗涤液200μl，室温2min，加入抗体液200μl，室温20min，然后用2号洗涤液洗2次，3号洗涤液洗1次，向杂交舱中加入200μl显色液，41℃40min;⑤检测：在Baio基因芯片识读仪上检测。检测图像经Array Doctor软件分析自动输出检测结果。

　　1.3.2 IL1RN基因琼脂糖凝胶电泳分型：DNA抽提，PCR扩增方法同上。扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳(室温，80v,1.5h)，CDs800凝胶成像。结果判断标准：1/1基因型(442bp);2/2基因型(270bp);1/2基因型(442/270bp)。

　　1.3.3 幽门螺旋杆菌抗体检测 应用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定Hp抗体，按试剂盒说明进行。Hp感染的认定标准：血清IgG、IgA、IgM3项指标中有1项以上阳性者为Hp阳性(Hp+)，否则为Hp阴性(Hp-)。

　　1.4 统计学方法 数据处理使用SAS9.0统计学软件进行χ2检验，P<0.05，差异有统计学意义。以比值比(OR)及其95%可信区间(95%CI)估计相对风险度。用PHASE V2.0.2遗传学统计软件进行单体型分析。

　　2 结 果

　　2.1 Hp感染率 胃癌组：Hp阳性90例，感染率69.2%(90/130);对照组：Hp阳性66例，阳性率46.5%(66/142)(χ2=7.18 P=0.007;OR=2.53,95%CI=1.28~5.24)。 表1 IL1B31/511及IL1RN基因多态性与胃癌风险性的关系等位基因和基因型胃癌组

　　2.2 IL1B、IL1RN基因多态性与胃癌风险性的关系 由表1可见，胃腺癌组IL1B31TT和IL1B511TT基因型频率均显著高于对照组(χ2=5.28,P<0.05;OR=2.16,95%CI=1.12~4.17)(χ2=4.42,P<0.05;OR=1.81,95%CI=1.04~3.15)。部分芯片检测结果见图1，部分凝胶电泳检测结果见图2。 图1 IL1B31/511多态性基因芯片分型结果

　　2.3IL1B31/511单体型分析结果表明，胃腺癌组主要构成CT;CC;TT;TC 4个单体型，其频率分别为0.333,0.201,0.125,0.340。而此4个单体型在对对照组中的频率则依次为0.390,0.189,0.069,0.351。二组比较，单体型频率构成比差异有统计学意义(χ2=4.56，P<0.05)。

　　2.4IL1B/1RN基因多态性与性别的关系IL1B/1RN基因多态性频率在对照组男性和女性人群及胃腺癌组男性和女性患者之间未见统计学差异(P>0.05)，而二组之间差异亦无统计学意义(P>0.05)。 表2 胃癌IL1B/1RN多态性与Hp感染的关系

　　2.5IL-1B/1RN基因多态性与淋巴结转移的关系在有淋巴结转移的胃腺癌组(n=48)和无淋巴结转移的胃腺癌组(n=82)之间，未观察到IL1B/1RN基因多态性频率有显著差异(P>0.05)。

　　2.6IL-1B基因多态性与胃腺癌分化程度的关系低分化胃腺癌组(n=78)IL1B31TT基因型频率显著高于高分化胃腺癌组(n=20)(χ2=4.03，P<0.05;OR=6.55,95%CI=1.45~4.11)。

　　2.7IL1B/1RN基因多态性与胃腺癌Hp感染的关系仅见Hp+组IL1B511TT基因型及T等位基因频率明显高于Hp组(P<0.05，OR=2.55,95%CI=1.07~6.08, P<0.05,OR=1.78,95%CI=1.026~3.04)。见表2。

　　3讨论

　　细胞因子IL1B能促进胃部类症的产生与发展，启动或放大机体对Hp感染的炎性反应，是目前发现的最有力的抑酸剂。其抑酸作用可导致胃萎缩，从而增加胃癌发生的危险性。IL1Ra是IL1受体拮抗剂，能竞争性地与IL1受体结合，调控IL1的活性。E1Omar等[6]研究发现，IL1B31C/T SNP影响转录起始复合体的形成。携带TT基因型的个体比不携带者发生胃腺癌的危险性约高2倍(OR=1.9,95% CI=1.5~2.6)。杨婕等[10]认为，胃癌高发区IL1B31TT基因型使患胃癌的风险性增加了7倍以上。HP感染后首先导致慢性浅表性胃炎，进而发展为萎缩性胃炎、肠上皮化生，少数人进展为胃癌[11]，而此渐进过程需依赖宿主和细菌的基因因素[12，13]。Furuta[14]发现IL1B511T等位基因可致日本人高IL1β分泌量，后者抑制胃酸分泌，导致胃萎缩，进而诱发胃癌。其它多项研究也显示，IL1B511T等位基因可增加胃的IL1B产物，若合并Hp感染，最终将可能发展成为胃癌。本文发现，胃癌组中IL1B31TT/511TT基因型均显著高于对照组，311TT/511TT携带者比不携带者发生胃腺癌的危险性高2倍左右，该结果与以上多项文献报道基本相符，提示31TT/511TT基因型亦是济南地区胃腺癌的遗传易感因素;与Ruzzo A等[9]的结果相反，本文研究表明，Hp阳性胃腺癌组511TT基因型及T等位基因频率显著高于Hp阴性组，提示511 T等位基因与Hp感染可能协同致癌。单体型分析表明，二组间单体型频率构成比不同，胃癌组中TT单体型频率显著高于对照组，提示TT单体型可能是胃癌的遗传易感因素。本文还发现低分化胃腺癌组IL1B31TT基因型频率显著高于高分化胃腺癌组，31TT携带者比不携带者发生低分化胃癌的危险性高6倍以上。我们认为IL1B基因多态性与胃癌恶性程度的关系还需深入研究。

　　IL1RN多态性表现为数目可变的串联重复(variable rumber of tandem repeat,VNTR)，人类存在2~6次重复，5种不同组合的等位基因，本文仅检测到其中3种。国外多篇文献报道IL1RN2等位基因与IL1B产物增加有关，携带1/2、2/2基因型增加胃癌的易感性。但我们的结果与Steve Hartland等[15]的研究基本一致，即IL1RN各基因型及等位基因分布与胃腺癌无显著性相关。

　　参考文献

　　[1]Savage SA,Abnet CC,Haque K,et al.Polymorphisms in interleukin 2,6,and 10 are not associated with gastric cardia or esophageal cancer in a highrisk Chinese population[J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2004,13(9):15471549.

　　[2]Machado JC,Figueiredo C,CanedoP,et al.A proinflammatory genetic profile increases the risk for chronic atrophic gastritis and gastric carcinoma[J].Gastroenterology,2003,125(2):364713.

　　[3]Noach LA,Bosma NB,Jansen J,et al.Mucosal tumor necrosis factoralpha,interleukinⅠ beta,and interleukin8 production in patients with Helicobacter pylori infection.Scand[J].Gastroenterology,1994, (29):425429.

　　[4]Basso D,Scrigner M,Toma A,et al.Helicobacter pylori infection enhances mucosal interleukin1 beta,interleukin6,and the soluble receptor of interleukin2[J].Int J Clin Lab Res,1996, (26):207210.

　　[5]Arend WP,Malyak M,Guthridge CJ,et al.Interleukin1 receptor antagonist:role in biology[J].Annu Rev Immunol,1998,(16):2755.

　　[6]E1Omar EM,Carrington M,Chow WH,et al.Interleukin 1 polymorphisms associated with increased risk of gastric cancer[J].Nature,2000,404(6776):398402.

　　[7]Machado JC,Pharobah P,Sousa S,et al.Interleukin 1B and Interleukin 1RN polymorphism are associated with increasedrisk of gastric carcinoma[J].Gastroenterology,2001,121(4):823829.

　　[8]Kato S,Onda M,Yamada S,et al.Association of the interleukin 1B genetic polymorphism and gastric cancer risk in Japanese[J].Gastroenterology,2001,36:696699.

　　[9]Ruzzo A,Graziand F,Pizzagalli F,et al.Interleukin 1B gene (IL1B) and interleukin 1 receptor antagonist gene(IL1RN) polymorphisms in Helicobacter pylorinegative gastric cancer of intestinal and diffuse histotype[J].Ann Oncol,2005,16(6):887892.

　　[10]杨婕，湖之滨，徐耀初，等.IL1B及IL1RN基因多态性与胃癌易感性的关系[J].世界华人消化杂志，2004，12(8)：17691773.

　　[11]Correa P,Human gastric carcinogenesis:a multistep and multifactorial process.First American Cancer Society Award Lectrure on Cancer Epidemiology and Prevention[J].Cancer Res,1992,52:63756740.

　　[12]Blaser MJ.Linking Helicobacter pylori to gastric cancer[J].Nat Med,2000,6:376377.

　　[13]Peek RM,Blaser MJ.Helicobacter pylori and gastrointestinal tract adenocarcinomas[J].Nat Rev Cancer,2002,2:2837.

　　[14]Furuta T,E1Omar E,Xiao F,et al.Interleukin 1beta polymorphisms increased risk of hypochlorhydria and atrophic gastritis and reduce risk of duodenal ulcer recurrence in Japan[J].Gastroenterology,2002,123(1):92105.

　　[15]Steve artiand ,Juliall ewton,Michael riffin et al.A Functional polymorphism in the interleukin1 receptor1 gene is associated with increased risk of helicobacter pylori infection but not with gastric cancer[J].Dig Dis Sci,2004,49(9):1545

　　山东大学齐鲁医院 1检验科 2普外科 (山东 济南 250012)

　　山东大学临床医学院济南中心医院 3肿瘤科 4中心实验室 (山东 济南 250013)