两种端粒酶逆转录酶启动子真核表达载体的构建

　　作者：刘华　马春红　刘素侠　王晓燕　高立芬　韩丽辉　朱法良　张艳　杨咏梅　吴伟芳

　　【摘要】目的：构建hTERT启动子和保留HBV同源序列的缺失点变hTERT启动子(pGL3del445)的真核表达载体，为进一步研究HBV与hTERT启动子的关系奠定实验基础。方法：通过双酶切及PCR方法从pCRTRTP载体上将全长及含有HBV同源序列的hTERT启动子的基因序列克隆到pPLbasic多克隆位点上，构建真核表达载体pGL3TRTP与pGL3Bdel445，将该两质粒与pRLtk共转染不同细胞系，评估其端粒酶启动子活性。结果：经测序证明成功构建了全长及含有HBV同源序列的hTERT启动子的真核表达载体pGL3TRTP和pGL3Bdel445，共转染实验中，证实在永生细胞系中重组子高效表达，在非永生正常细胞中重组子不表达。结论：构建的两种重组表达载体具有端粒酶启动子活性，在不同端粒酶表型的细胞系中其表达具有选择性。

　　【关键词】端粒酶逆转录酶?启动子?基因表达?基因融合?肝炎病毒，乙型

　　Construction of two different recombinant plasmids containing human telomerase reverse transcriptase gene promoter

　　LIU Hua,MA Chunhong,LIU Suxia,WANG Xiaoyan,GAO Li　fen,HAN Lihui,ZHU Faliang,ZHANG Yan,YANG Yongmei,WU Weifang

　　1Immunology Institute,2Institute of Biochemistry and Molecnlar Biology,School of

　　Medicine,Shandong University (Jinan 250012,China)

　　【ABSTRACT】Objective:To construct two eukaryotic expression vector containing human telomerase reverse transcriptase (hTERT) gene promoter.Methods:FULLlength and deleted hTERT promoter sequence which contain HBV homology sequence were respectively cloned into pGL3basic multiple cloning sites to construct recombinant plasmids pGL3TRTP and pGL3Bdel445.To detect the transcriptional activity of hTERT promoter in the plasmids,transient transfection was performed in different cells.pRLtk was used to mormalize the transfection efficiency.Results:The sequencing data of expression vectors was correspondence with the design.The results of transient showed that the two recombinant plasmids could highly expressed in immortal cells Lo2 and carcinoma cells BEL7402,but not in mortal cells.Conclusion:Two different recombinant plasmids containing hTERP promoter has been successfully constrcucted which could selectively express in hTERT positive cells.

　　【KEY WORDS】hTERT?Promoter regions(Genetiss)?Gene expression?Gene fusion?Hapatitis B virus

　　研究表明，端粒酶在80%的肿瘤中被激活高表达，而在乙肝病毒(HBV)相关肝细胞癌(HCC)中端粒酶100%强阳性表达，提示HBV感染与端粒酶激活有关。端粒酶逆转录酶(TERP)是激活端粒酶的重要组份[1]，1999年Horikawa在克隆hTERT启动子时发现，hTERT基因启动子区域存在着HBV的同源序列[2]。我们的前期研究结果证实反义核酸封闭HBV基因表达可显著降低肝癌细胞端粒酶活性，降低hTERT表达[3]。为进一步研究HBV与hTERT启动子的关系，本文构建了全长及含有HBV同源序列的hTERT启动子的真核表达载体，并在体外试验中评估其活性。

　　1 材料与方法

　　1.1材料

　　1.1.1试剂

　　小牛血清购自杭州四季青生物工程材料研究所，限制性内切酶KpnⅠ、HindⅢ、SacⅠ及XhoⅠ、T4连接酶、GC高含量PCR扩增试剂盒均购自大连宝生物公司，UNIQUE10柱式DNA胶回收试剂盒购自上海生工生物工程公司，小量质粒抽提试剂盒购自Qiagen公司，双荧光检测试剂盒购自Promega公司。

　　1.1.2质粒

　　含有hTERT启动子全长序列的pCRTRTP质粒由美国Horikawa教授惠赠，pGL3basic无启动子与增强子，可在插入外源启动子作用下表达萤光虫荧光素酶，pGL3control含有SV40启动子/增强子，可表达萤光虫荧光素酶、pRLtk可表达海肾荧光素酶，以上质粒均为Promega公司产品。

　　1.1.3细胞

　　肝癌细胞系Be17402由本室保存，肝细胞系L02购自上海中科院细胞所，HELF(人胚胎肺纤维细胞)取自15周龄流产胎儿肺组织。上述细胞常规培养于10%FCS的RPMI1640培养液，在37℃、5%CO2条件下进行培养。

　　1.2方法

　　1.2.1端粒酶启动子目的基因片段的扩增与纯化

　　1.2.1.1缺失启动子基因片断的扩增

　　根据PubMed中端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子基因序列(序列号：AF098956)，设计引物：P1：5’AGGTACCGCCAAAGGCTCGCCGCACGCA 3’，P2：5’ TAAAGCTTAACGTGGCCAGCGGCAGCA3’(P1/P2分别加有KpnⅠ、HindⅢ酶切位点)，用来扩增hTERT启动子基因del445(445nt150nt，目的片段长595bp)，该基因片段含有HBV同源序列[3]。以质粒pCRTRTPDNA为模板，用GC高含量PCR扩增试剂盒扩增目的基因。25μLPCR反应体系中含有质粒DNA1ng、2×GC buffer 12.5μL、dNTP 4μL、Takara LA Tap酶5U及上、下游引物名20nmol/L。目的片段PCR反应条件为：94℃预变性1min后进行30个循环(94℃ 45s,55℃ 1min,72℃ 1min)，72℃延伸 10min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳后，切下含目的基因片段的凝胶，按DNA纯化回收试剂盒操作步骤回收扩增产物。

　　1.2.1.2 、全长端粒酶逆转录酶启动子基因片段的扩增

　　以SacⅠ、XhoⅠ双酶切pCRTRTP，得到全长hTERT启动子。将酶切产物经1%琼指糖凝胶电泳后，回收目的片断，方法如前。

　　1.2.2重组真核表达载体的构建

　　上述酶切纯化DNA，分别克隆至质粒pGL3basic KpnⅠ、HindⅢ与SacⅠ、XhoⅠ多克隆位点，构建含有del445基因重组质粒pGL3del445与全长hTERT启动子重组质粒pGL3TRTP。重组子分别经酶切和PCR鉴定后，并经DNA测序验证。DNA测序由上海博亚生物工程公司完成。

　　1.2.3启动子活性的鉴定

　　取0.4μg重组质粒pGL3del445或pGL3TRTP,转染HELF、L02和Be17402细胞，设空载体pGL3basic做阴性对照，pGL3control做阳性对照。同时每孔转染16ng pRLTK质粒DNA做为转染率内参照。转染过程依照Lipofectamine TM2000脂质体转染试剂盒使用说明进行，并对具体条件进行优化。大致为：以含10%小牛血清的RPMI1640完全培养基培养HELF、L02与HepG2细胞。转染前18~24h，将处于对数增长期的HELF、L02与Bel7402细胞消化传代，分别按2.0×105/孔、1.5×105/孔、1.5×105/孔接种于24孔培养板中。次日至细胞密度大约为80%时，用无血清MEM培养基给细胞换液，于每扎转染细胞中加预先配制好的DNA脂质体复合物0.1ml，脂质体与DNA的比例为1μ1:0.4μg，混匀，培养7h后，换为含有10%小牛血清RPMI1640，继续37℃，5%CO2培养48h，收集细胞80℃保存。按双报告基因试剂盒说明书将细胞裂解后与底物混合，用荧光计数仪检测萤火虫荧光强度M1与海肾荧光强度表达强度M2。每次试验设2个复孔，同一转染试验至少重复3次。

　　2 结果

　　2.1 目的基因片段的扩增

　　以P1、P2为引物PCR扩增获得含有HBV同源序列的hTERT启动子基因片段，2%琼脂糖凝胶电泳显示DNA片段为595bp左右，与预期一致。以SacⅠ、XhoⅠ双酶切pCRTRTP获得1786bp，1%琼脂糖凝胶电泳显示DNA片段为1786左右，与预期一致。

　　2.2两种启动子重组真核表达质粒的构建与鉴定

　　PCR产物与双酶切目的片断分别体外重组至真核表达载体pGL3basic，构建hTERT启动子缺失重组质粒pGL3del445与全长hTERT启动子重组质粒pGL3TRTP。1%琼脂糖凝胶电泳显示pGL3del445KpnⅠ单酶切可见大约5413bp的片段，KpnⅠ、HindⅢ双酶切可获得595bp和4818bp左右的条带，与预期一致(见图1(略));以p1、p2为引物，重组质粒为模板，PCR扩增出595bp左右的片段，与预期一致(见图2(略));pGL3TRTP分别经XhoⅠ单酶切及SacⅠ、XhoⅠ双酶切，1%琼脂糖凝胶电泳分别显示7299bp，5413bp与1886bp左右的条带，与预期一致(见图2(略))。序列测定表明两重组载体插入片段与hTERT启动子一致，且插入方向正确(见图3，4(略))。

　　2.3 端粒酶启动子活性的鉴定

　　pGL3basic带有荧火虫荧光素酶，可在外源启动子的作用下表达荧光素酶。pRLtk质粒可在真核细胞中表达海肾荧光素酶。本实验以pRLtk表达的海肾荧光素酶作为内参，消除转染率的影响。采用双荧光素酶报告基因测试系统，分别测定细胞粗提液中萤光虫荧光素酶和海肾荧光素酶活性，以萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶活性的比值(M1/M2)表示重组子hTERT启动子相对活性。同时转染pGL3control作为阳性对照。结果发现重组子pGL3del445、pGL3TRTP在永生细胞L02及Be17402中表达量明显高于空质粒pGL3basic。pGL3del445高出15.381,13.481倍，pGL3TRTP高出15.351,23.726倍。非永生细胞HELF不表达启动子活性，说明所构建的hTERT启动子具有端粒酶启动子活性(见图5(略))。

　　3　讨、论

　　端粒酶是一种核酸蛋白复合分子，能以自身携带的RNA为模板合成端粒DNA的富G链，稳定端粒DNA长度。除造血干细胞等具有高度再生及增殖能力的细胞外，正常人类体细胞中端粒酶是失活的或低活性的，实验发现许多肿瘤细胞的端粒酶活性增高。在肿瘤发展过程中端粒酶活性与hTERT的过表达相关。hTERT是近年来在端粒酶研究中发现的端粒酶激活的限速因素，对hTERT的调节包括转录、转录后、蛋白磷酸化等多方面，但是通过对其启动子的调节而对hTERT的转录进行调节是主要的调节方式。研究表明一些病毒编码的蛋白可以促进细胞转化，他们通过介导细胞信号传导途径而调节细胞周期、细胞增殖、细胞分化与细胞死亡。最近有资料显示人类肿瘤相关病毒可作用于端粒酶逆转录酶以活化端粒酶。人类乳头状瘤病毒16型与18型可使角化上皮细胞转化、永生化，从而导致子宫颈癌的发生发展。人类乳头状瘤病毒的致癌作用主要由于E6与E7癌蛋白可抑制p53与Rb的抑癌作用[4]。2001年Stephen在研究人类乳头状瘤病毒16型E6癌蛋白时发现，E6癌蛋白能通过与hTERT起始密码上游258bp的启动子片段上的某些顺式作用元件相结合而诱导正常人角化上皮细胞中hTERT的表达，对该片段上的两个Ebox及5个SP1结合位点分别进行突变，均能导致hTERT表达的下调 ，而对Ebox及SP1结合位点均进行突变则可导致所有E6癌蛋白诱导作用的消失。[5]。

　　HCC的发生与HBV的整合及整合后染色体重排有关。HBVDNA的整合可致宿主细胞染色体片段的缺失及整合后染色体的重排，由此引起的染色体DNA的不稳定性，可能是HBV致癌的机制之一。有研究证实，HBVDNA在肝癌细胞内以整合于染色体上作为存在的主要方式，整合的HBVDNA片段可作为基因转录的模板而表达相应的基因蛋白[6]。1999年Izumi Horikawa在克隆端粒酶逆转录启动子基因时，发现其启动子基因序列中存在HBV preS2序列[2]。2001年Izumi Horikawa又证明在整合在肝癌细胞系huH4细胞hTERT启动子区中HBV基因序列含有增强子，整合序列可发挥顺式激活hTERT启动子的作用[7]。同年Gozuacik等报道18例HBV相关的HCC病例中，有1例hTERT上游整合有HBV基因序列，与周围正常组织相比，在瘤细胞内它可以增加hTERT蛋白的表达[8]。2003年Ferber又进一步证明整合在hTERT区域的致癌基因(如HBV，HPV)可激活hTERT的转录、端粒酶活性，细胞永生化，并导致肿瘤的易感性[9]。这提示我们整合在hTERT启动子区的HBV序列在激活hTERT转录中发挥重要作用。本室前期研究已经证实反义封闭HBV preS2基因可抑制细胞端粒酶活性，因而进一步探讨HBV与端粒酶激活的关系意义重大。为此在本研究中我们首先构建了不同长度的带有hTERT启动子的重组子。参考Izumi Horikawa对HBV preS2同源序列的定位，我们设计了两种不同长度的hTERT启动子的重组子：带有全长hTERT启动子的表达载体pGL3TRTP和保留了HBV preS2同源序列(371307)的缺失启动子表达载体pGL3del445，测序结果证实构建重组子成功。

　　为验证重组载体表达产物的反式激活作用，采用双荧光素酶报告基因检测系统，将重组子与pRLtk共转染不同细胞系。表达海肾荧光素酶的 pRLtk为内参照，它可以消除实验中不同测试之间所固有的变化，包括培养细胞的数目及活力的差异，细胞转染及裂解的效力。通过统计学分析，结果显示所构建的两种端粒酶启动子表达载体具有启动子活性，并可选择性的在细胞中表达。在永生细胞系Be17402、L02中高效表达，在非永生细胞HELF中不表达。本研究为进一步研究HBV与hTERT转录活性相关性奠定了试验基础。

　　参 考 文 献

　　[1]Tzukerman M,Shachaf C,Ravel Y.Identification of a novel transcription factor binding element involved in the regulation by differentiation of the human telomerase (hTERT) promoter[J].Mol Biol Cell,2000,11(12):43814391.

　　[2]I zumi Horikawa,P LouAnn Cable,Cynthia Afshari,et al.Cloning and characterization of the promoter region of the human telomerase reverse transcriptase gene[J].Cancer Res,1999,59:826830.

　　[3]马春红，孙汶生，丁培芳，等.preS2反义寡核苷酸降低端粒酶活性及诱导肝癌细胞调亡的作用[J].中华微生物学和免疫学学报，2000，20(5)：461.

　　[4]Veldman T Horikawa I,Barrett J C et al.Transcriptional activation of the telomerase hTERT gene by human papillomavirus type 16 E6 oncoprotein[J].J Virol,2001,75:44674472.

　　[5]Oh ST,Kyo S,Laimins LA.Telomerase activation by human papillomavirus type 16 E6 protein:induction of human telomerase reverse transcriptase expression through Myc and GCrich Sp1 binding sites[J].J Virol,2001,75(12):55595566.

　　[6]高丰光，王迎伟，孙汶生，等.HBV整合的致癌性研究[J].中华微生物学和免疫学杂志，2004，24(4)：291.

　　[7]Izumi Horikawa,J Carl Barrett.Cisactivation of the human telomerase gene (hTERT) by the hepatitis B virus genome[J]J Natl Cancer Inst,2001,93(15):11711173.

　　[8]Gozuacik D,Murakami Y,Saigo K,et al.Identification of human cancerrelated genes by naturally occurring Hepatitis B virus DNA tagging[J].Oncogene,2001,20:62336240.

　　[9]Ferber MJ,Montoya DP,Yu C,et al.Integrations of the hepatitis B virus (HBV) and human papillomavirus (HPV) into the human telomerase reverse transcriptase (hTERT) gene in liver and cervical cancers[J].Oncogen,2003,22:38133820.

　　山东大学医学院1免疫研究所 2分子生物化学研究所(山东济南　250012)