TNP470对胃癌细胞株SGC7901体外血管生成拟态的抑制作用

　　作者：吴清　孙启龙　丁印鲁　李兆亭

　　1山东大学齐鲁医院普通外科(山东济南 250012)

　　2山东大学第二医院普外科(山东济南 250033)

　　【摘要】目的：研究TNP470对胃癌细胞株SGC7901体外血管生成拟态的影响。方法：将培养的SGC7901细胞分为TNP470组及对照组，应用克隆形成试验检测细胞增殖活性的变化。Transwell小室检测癌细胞体外侵袭力的变化，体外管状形成试验检测管道形成能力的变化。结果：TNP470对SGC7901细胞增殖没有明显抑制作用，可以显著降低SGC7901细胞的体外侵袭能力，抑制体外管道形成。结论：TNP470能够抑制SGC7901细胞的体外血管生成拟态形成。

　　【关键词】胃肿瘤?血管生成拟态?血管生成抑制剂

　　Inhibitive effect of TNP470 on vasculogenic mimicry in gastric cancer cell line SGC7901 in vitro

　　WU Qing,SUN Qilong,DING Yinlu,LI Zhaoting

　　1Department of General Surgery,Qilu Hospital of Shandong University(Jinan 250012,China)

　　2Department of General Surgery,the Second Affiliated Hospital of Shandong Univer

　　sity(Jinan 250033,China)

　　【ABSTRACT】Objective:To investigate the effect of TNP470 on the vasculogenic mimicry in gastric cancer cell line SGC7901 in vitro.Methods:Cultured SGC7901 cells were devided into TNP470 group and control group.The effect of proliferation,invasion and tube formation on SGC7901 cells were detected by colone formation assay,invasion assay and tube formation assay respectively in vitro.Results:Number of colone formation of TNP470 group was not significantly lower than the control group(P0.05),the number of cells which crossed to the lower surface of the matrigelcoated filters in TNP470 group was significantly lower than the control group(P0.01).Tube formation could be inhibited by TNP470.Conclusion:TNP470 can inhibit the vasculogenic mimicry formation of gastric cancer cell line SGC7901 in vitro.

　　【KEY WORDS】Stomach neoplasms?Vasculogenic mimicry?Angiogenesis inhibitors

　　肿瘤的生长和转移需要血液供应，以往认为内皮细胞形成的血管提供了肿瘤需要的所有血液供应。Maniotis AJ等发现具有高度侵犯性的黑色素瘤组织可以形成模拟的血管通道并称之为血管生成拟态(vasculogenic mimicry,VM)[1]。拟态样血管管道内无内皮细胞衬覆，肿瘤细胞模仿机体血管而形成瘤细胞条索并围绕成管道，其内有血液流动。血管生成拟态的提出对传统的针对内皮细胞的抗肿瘤新生血管治疗提出了挑战。我们以SGC7901细胞株为对象，研究了血管生成抑制剂TNP470对胃癌体外血管生成拟态的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要材料

　　人胃癌细胞株SGC7901为上皮样中分化腺癌，山东大学齐鲁医院贾晓青博士惠赠。10%小牛血清购自杭州四季青公司，RPMI1640培养液为Gibico产品， 0.25%胰蛋白酶购自Sigma公司。 TNP470为日本Takeda公司产品，使用前无水乙醇溶解，5%阿拉伯胶稀液。Transwell 小室为一杯状结构，杯孔直径6.5mm，为COSTER公司产品。聚碳酸脂微孔滤膜为Watllman公司产品，8μm孔径，人工基质Matrigel为B、D公司产品。

　　1.2方法

　　1.2.1　平板克隆形成试验

　　常规细胞培养 ，取对数生长期的SGC7901细胞，按每孔300个接种于6孔板，每组接种 4孔，轻轻晃动，使细胞分散均匀。实验组每孔加TNP470 ，使终浓度为2μg/ml，对照组加等体积的2%乙醇和5%阿拉伯胶。将培养板移入37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中，静止培养2周后终止培养，弃培养液，PBS漂洗，纯甲醇固定15min,Giemsa染色10min，流水冲去染液，空气干燥。分别于显微镜下记数克隆数(大于50个细胞以上者计为一个克隆)，计算每组平均值。

　　1.2.2 体外侵袭试验

　　Transwell小室杯底由8μm孔径的聚碳酸脂微孔滤膜封闭。滤膜上均匀涂1∶5RPMYI 1640稀释的人工基质Matrigel,约50μg/小室。制备好的小室用紫外线照射2h杀菌，使用前加入少量无血清的培养基水化。小室的下室加入0.5ml无血清培养24h的NIH3T3细胞上清液。调整细胞浓度为2×105/ml，上室加入收获的细胞悬液25μl。实验组每孔加TNP470 ，使终浓度为2μg/ml，对照组处理同克隆形成试验。每组3个复孔。培养12h后取出滤膜，甲醇固定，常规HE染色。随机于显微镜下取上、下、左、右、中心共5个视野，计数穿膜细胞数，取每个视野的平均数表示肿瘤细胞的侵袭能力。

　　1.2.3 体外管道形成试验

　　取24孔培养板每孔加入300μlMatrigel原液，37℃培养箱内温育30min待凝固后再在每孔内添加1ml浓度为1.5×106个/ml的SGC7901细胞悬液，实验组及对照组处理同前。37℃、5%的CO2条件下继续培养，8h后观察不同处理组之间的SGC7901细胞管状排列情况及完整程度，随机于显微镜下(×200)取上、下、左、右、中心5个视野，计数管状结构数量，取每个视野的平均值。

　　1.3 统计学方法

　　采用SPSS10.0软件中的两个独立样本的t检验，P0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 平板克隆形成试验

　　TNP470组与对照组的克隆形成数目分别为31.8±6.7个、37.6±8.4，但差异无统计学意义(P 0.05)。提示TNP470对单个癌细胞的增殖能力无明显抑制作用。

　　2.2 体外侵袭试验

　　两组细胞均能够穿过铺有Matrigel的滤膜;对照组、TNP470组侵过滤膜的细胞数目分别为202.8±26.2、118.4±11.1，表明TNP470能够显著降低SGC7901细胞的体外侵袭能力(P0.01)。

　　2.3 体外管道形成试验

　　对照组、TNP470组细胞于体外均可以形成管道状结构，呈单个环状或多个环相连的网格状。但对照组所形成的管道结构排列较TNP470组整齐，且较多而完整(见图1(略))。于显微镜下观察，对照组平均每视野管状结构数量显著高于TNP470组(52.8±8.6 VS 24.4±7.2,P0.05)。

　　3 讨论

　　在恶性度较高的肿瘤中，为了满足肿瘤细胞快速生长需要，足够多的氧气和营养物质，单纯依靠机体血管输送氧气和营养物质似乎难以满足肿瘤组织的需要，在这种情况下，肿瘤细胞通过自身的变形以及产生细胞外基质模仿血管壁结构形成可输送血液的管道系统，从而重塑肿瘤微循环，并与宿主血管相连使肿瘤获得足够的血液供应。肿瘤内细胞通过拟态样血管获得血供，这种方式比较独特。恶性黑色素瘤[1]、乳腺癌[2]、卵巢癌[3]、恶性胶质瘤[4、5]、直肠癌[6]等组织中以及相应的细胞株都具有形成拟态样血管样通道的能力。肿瘤细胞之所以能够模仿内皮细胞，与一些内皮相关基因如Tie1、Tie2、VEcadherin[7]等活化有关。血管生成拟态与肿瘤的侵袭、转移等生物学行为有关。有血管生成拟态的黑色素瘤转移率高于无血管生成拟态者，生存时间短，且血管生成拟态对预后的影响程度大于如肿瘤大小、有丝分裂活性等因素[1];有无血管生成拟态的乳腺癌5年生存率分别为65%对77%，前者显著短于后者[2]。

　　TNP470是一种人工合成的烟曲霉素衍生物，其抗肿瘤血管生成活性比烟曲霉素强10倍且无明显的毒副作用。TNP470可以抑制毛细血管内皮细胞的增殖、迁移和毛细血管腔的形成，并能够抑制多种肿瘤在动物体内的生长和转移。TNP470对口腔鳞状细胞癌细胞株HSC2在联合免疫缺陷的SCID鼠皮下移植瘤的生长抑制作用呈剂量效应关系，它可以降低肿瘤组织周围的微血管形成，对口腔鳞状细胞癌细胞的体外增殖也有抑制作用，但作用肿瘤细胞的IC50值是作用内皮细胞的1700倍，说明TNP470的抗肿瘤作用主要是针对血管内皮细胞从而抑制微血管形成[8]。

　　新生血管的形成需要内皮细胞增殖、迁移、侵袭和管状结构形成等过程。传统的抗血管新生治疗主要针对血管内皮细胞，而对肿瘤自身能够形成血管未加以考虑。血管生成拟态的发现既是对传统的抗肿瘤血管新生治疗的挑战，也是对它的补充。我们发现SGC7901胃癌在体外能够形成管状结构;针对血管内皮细胞的血管生成抑制剂TNP470虽然对SGC7901细胞的增殖无明显抑制作用，但能够显著降低其侵袭能力，进而抑制其体外管状结构的形成。这对TNP470应用于抗肿瘤治疗又提供了新的理论依据，使其在临床应用的前景更加广阔。

　　参　考　文　献

　　[1]Maniotis AJ,Folberg R,Hess A,et al.Vascular channel formation by human melanoma cells in vivo and vitro:vasculogenic mimicry[J].Am J Pathol,1999,155:739752.

　　[2]Shirakawa K,Wakasugi H,Heike Y,et al.Vasculogenic mimicry and pseudocomedo formation in breast cancer[J].Int J Cancer,2002,99:821828.

　　[3]SoodAK,Seftor EA,Fletcher MS,et al.Molecular Determinants of ovarian cancer plasticity[J].Am J Pathol,2001,158(4):12791288.

　　[4]Barinaga M.New type of blood vessel found in tumors[J].Science,1999,285(5433):1475.

　　[5]朱洪新，李锦军，杨艳华，等.ANGPTL4基因对大鼠胶质瘤细胞系C6血管通道形成的影响[J].肿瘤，2002,22(2):8789.

　　[6]刘丰，傅仲学，宋炯.Survivin的表达与直肠癌细胞凋亡、血管形成及预后的关系[J].中国现代普通外科进展，2004，7(3)：162.

　　[7]Hendrix MJ,Seftor EA,Meltzer LM,et al.Expression and functional significance of VEcadherin in aggressive human melanoma cells:Role in vasculogenic mimicry[J].Proc Nat1 Acad Sei USA,2001,98(14):80188023.

　　[8]Ueda N,Kamata N,Hayashi E,et al.Effects of an antiangiogenicagent,TNP470,on the growth of oral squamous cell carcinomas[J].Oral Oncol,1999,35:554560.

　　吴清,等.TNP470对胃癌细胞株SGC7901体外血管生成拟态的抑制作用