乳腺浸润性导管癌中miR-125b的表达及其临床意义

　　作者：沈淑蓉，沈贤，朱仁武，姜阳贵，施俊义 作者单位：1.温州市中西医结合医院 普外科，浙江 温州 325000;2.温州医学院附属第一医院 普外科，浙江 温州 325000;3.第二军医大学附属长海医院 普外科，上海 200433

　　【摘要】 目的 ：探讨miR-125b在乳腺浸润性导管癌中的表达及其与临床病理特征的相关性。方法 ：应用 Realtime RT-PCR方法检测42例乳腺浸润性导管癌及癌旁非肿瘤乳腺组织中miR-125b的表达，分析miR-125b表达与乳腺癌常用的临床病理指标的关系。结果：miR-125b在癌组织中的表达低于非肿瘤组织，差异有显著性(P<0.01);miR-125b的表达与乳腺癌的淋巴结转移状态及Her-2的表达相关(P =0.019和P =0.033)，miR-125b的表达与年龄、肿块大小、临床病理分期及雌、孕激素状态未见显著相关性。结论： miR-125b在乳腺浸润性导管癌中的表达异常，可能和乳腺癌的侵袭转移等恶性生物学行为有关，有望成为判断乳腺癌预后的指标及治疗靶点。

　　【关键词】 miR-125b 乳腺肿瘤

　　Expression of miR-125b and its clinical significance in invasive ductal carcinoma of the breast cancer SHEN Shu-rong*，SHEN Xian，ZHU Ren-wu，JIANG Yang-gui，SHI Jun-yi. *Department of General Surgery， Wenzhou Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine，Wenzhou，325000

　　Abstract: Objective: To explore the expression of miR-125b and the correlativity of clinico-pathologic features in invasive ductal carcinoma of the breast cancer. Methods: The expression levels of miR-125b in 42 invasive ductal carcinoma of the breast cancer and their matched non-tumor adjacent tissue specimens were examined using stem-loop real-time RT-PCR. the relationship between the expression of miR-125b and its relevant clinicopathologic features of breast cancer was analyzed. Results: Expression levels of miR-125b was significantly lower in tumor than that of the adjacent normal tissues(P<0.01);Down-regulation expression of miR-125b was associated with lymph node positivity (P =0.019)and expressions of Her-2 (P =0.033) in breast cancer patients. There was no significance among the patient age，the size of tumor， breast cancer TNM clinical stage， and the condition of Estrogen/Progesterone receptor. Conclusion: The level of miR-125b expression in invasive ductal carcinoma of the breast cancer may be correlated with the metastasis character， and it may be a potential adjuvant parameter in forecasting the prognosis and a therapeutic target.

　　具有重要基因表达调节功能的miRNA(MicroRNA)不仅调控生物体正常的生长发育，而且和疾病有很大的关系。最近发现其在肿瘤的发生、发展过程中起着很重要的调控枢纽效应，为此有抑癌和促癌miRNA之分[1]。近年来的研究表明，miR-125b不但在多种肿瘤中表达下调，而且侵袭转移能力强的肿瘤下调更明显[2]。本研究通过Real-time RT-PCR方法检测了42例乳腺浸润性导管癌中miR-125b的表达，分析它们和临床病理特征的联系，探讨miR-125b在乳腺癌中的作用。

　　1 资料和方法

　　1.1 一般资料 42例女性乳腺浸润性导管癌标本采自2007年1月至2008年9月温州市中西医结合医院肿瘤科及温州医学院附属第一医院肿瘤科住院手术治疗的患者，术前未行放、化疗及内分泌治疗，年龄31～74岁，中位年龄55岁。乳腺癌组织标本取自病灶中央无坏死部分，同时取距肿瘤3 cm左右的癌旁非肿瘤乳腺组织，离体后5 min内用液氮保存。乳腺癌的诊断及常规病理资料由病理科医生盲法阅片后提供。Her-2受体的阳性标准为：参照FDA推荐的HercepTest[3]结果评分标准，阳性染色定位于细胞膜，根据阳性细胞的比例分为4个级别：阴性(-)，无阳性细胞表达;弱阳性(+)，<10%的区域有阳性细胞表达，胞膜显色不连续;中度阳性(++)，>10%的区域有阳性细胞表达，胞膜显色不连续;强阳性(+++)，>10%的区域有阳性细胞表达，胞膜显色连续。ER受体和PR受体的阳性标准为：肿瘤细胞阳性数大于10%，小于等于10%则认定为阴性。

　　1.2 RNA抽提 液氮保存的乳腺肿瘤及瘤旁非肿瘤乳腺组织标本在液氮中研磨至粉末状，按每100 mg组织加入1 mL Trizol(购自Invitrogen公司)的比例混匀，彻底溶解标本。按Trizol试剂说明书提取总RNA，为增加小RNA得率，异丙醇沉淀步骤改为-20 ℃沉淀2 h以上。最后以DEPC处理水溶解RNA，测定OD280/260。取2～5μg总RNA以1%琼脂糖变性凝胶电泳检测RNA的完整性。高质量RNA的28S与18S条带亮度在凝胶中约2:1。

　　1.3 RT-PCR检测miR-125 RT-PCR所用引物由上海英骏生物技术有限公司合成，其序列见表1， miRNA茎环RT-PCR分析参考文献[4]，1μg总RNA以miRNA茎环RT引物进行逆转录。为准备定量PCR内参模板cDNA，用于进行RT反应相同的总RNA标本，以oligo dT(购自Takara公司)为逆转录引物进行逆转录。MiRNA Real-time RT-PCR检测反应体系包括：1μL RT产物，1×SYBR Green I Mastermix(购自Takara公司)，0.5μmol/L miRNA特异前向引物、0.5μmol/L通用的反向引物。GAPDH内参分析除使用1μL oligo dT逆转录的RT产物外，使用0.5μmol/L特异的前向和反向引物。RT-PCR条件为：95 ℃ 10 min后，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40循环。所有样品做3个复孔。记录每个反应管中的荧光信号到达所设定的域值时所经历的循环数(Ct值)，以GAPDH作为内参照，以2-DCt表示目的基因的相对表达量，其中△Ct=(CtmiR-125-CtGAPDH)。

　　1.4 统计学处理方法 miR-125b在乳腺癌中的表达以其相对于癌旁非肿瘤组织的百分比表示，配对的肿瘤与瘤旁组织中miR-125b表达比较采用配对t检验，miR-125b表达与乳腺癌临床病理特征的关系采用卡方分析。

　　2 结果

　　2.1 乳腺癌组织中miR-125b的表达水平 乳腺癌组织中miR-125b的表达水平以其对应的癌旁非肿瘤乳腺组织为对照，乳腺癌组织中miR-125b表达为正常乳腺组织的55.67%(见图1)，与配对非肿瘤乳腺组织比较，差异有显著性(P<0.01)。将降低50%及以上定义为低表达，降低小于50%的定义为正常表达，本组42例标本中，降低大于50%的有17例，占40.5%。

　　2.2 乳腺癌中miR-125b表达与乳腺癌常见临床病理特征的关系 由表2可见，miR-125b在乳腺癌的不同的临床病理特征中，表达水平不同。在有淋巴结转移组中的miR-125b低表达占58.3%(14/24)，在无淋巴结转移组中，miR-125低表达的占28%(4/18)，差异有显著性(P <0.05);此外它的表达还和Her-2的表达水平有关，Her-2高表达组中的 miR-125b低表达占72.7%(8/11)，Her-2低表达组中，miR-125b低表达的占32.3%(10/31)，差异有显著性(P <0.05)。miR-125b的表达和年龄大小、肿块大小、临床病理分期、雌激素和孕激素受体状态无关。

　　3 讨论

　　乳腺癌是严重威胁妇女健康的恶性肿瘤，发病率高，占女性癌症死因的第2位。手术仍为乳腺癌最主要的治疗手段，但实践证明手术范围的盲目扩大并不能提高其长期生存率[5]。近年来不断提高的生存率主要得益于化疗、放疗、内分泌治疗及生物靶向治疗。未来最有希望提高生存率的治疗手段当属靶向治疗，因此寻找有效的治疗靶点是当前研究的热点。以往研究发现的靶点大多为编码蛋白的基因，近年来非编码microRNA的发现为寻找新的治疗靶点提供了一个新的方向。miRNA长度只有22 nt，但能以部分互补或完全互补的方式结合到靶基因mRNA的3’端非翻译区(3’UTR)，沉默基因的表达[6]。一种miRNA可以作用于多个靶点，因此可以高效调节基因的表达。

　　由于高通量微阵列芯片的应用，目前在许多肿瘤中均筛选出了肿瘤相关的miRNA谱。Iorio等[7]在筛选乳腺癌的miRNA表达谱中发现miRNA-125b在乳腺癌中表达下调。本研究应用RT-PCR技术检测了42例乳腺浸润性导管癌组织及对应的癌旁正常组织，证实了miR-125b在乳腺癌中表达下调。这些结果提示其可能起着抑癌的作用，因此miR-125b的靶基因应该为癌基因。Scott等[8]在乳腺癌细胞株中发现癌基因Her-2为miR-125b的靶基因之一。Her-2是目前在乳腺癌中研究最为深入的癌基因之一，它参与抑制细胞凋亡，促进肿瘤细胞存活，促进肿瘤新生血管生成，增加肿瘤细胞的侵袭力。Her-2基因过表达的乳腺癌的侵袭性和转移能力明显增高，其预后差。Scott等同时也证明了在乳腺癌细胞株中过表达miR-125b后能够抑制细胞的生长、迁徙及侵袭能力，因此miR-125b极有可能通过抑制Her-2等癌基因的表达而起到抑癌的作用，但上述的研究结果为体外细胞株实验的结果，miR-125b在活体癌组织中是否和Her-2表达相关以及是否和乳腺癌的侵袭性相关鲜见报道。本研究在检测活体癌组织标本中发现，miR-125b的表达和Her-2的表达呈负相关的关系，并且和乳腺癌的腋淋巴结转移有关，进一步验证了miR-125b可能在乳腺癌的发生、发展及转移中起重要的调控作用。此外，令人感兴趣的是Scott等[8]通过生物信息学发现，和Her-2相似，Her-3 mRNA的3’UTR亦有一个可以和miR-125b结合的区域。而既往的研究表明，Her-2单体基本无活性，只有和Her家族的其他三个成员(Her-1、Her-3、Her-4)之间形成二聚体才能和配体稳定结合。其中Her-3 与Her-2 结合形成的异源二聚体具有最强的促分裂能力，与人类上皮组织肿瘤的关系最密切[9]。由于一种miRNA可以同时高效抑制多个靶基因的表达[10]，因此miR-125b有可能通过同步下调Her-2和Her-3的表达而发挥更大的作用。综上所述，上调乳腺癌细胞中miR-125b的表达，就有可能抑制Her-2、Her-3等靶癌基因的表达，从而逆转乳腺癌的恶性生物学行为。至于其能否成为乳腺癌的治疗靶点，有待进一步的研究。

　　【参考文献】

　　[1] Chen CZ.MicroRNAs as oncogenes and tumor suppressors[J].N Engl J Med,2005,353(17):1768-1771.

　　[2] Cayqill EE,Johnston LA.Temporal regulation of metamor-phic processes in Drosophila by the let-7 and miR-125heterochronic microRNAs[J].Curr Biol, 2008, 18(13):943-50.

　　[3] Tang F, Hajkova P, Barton SC, et al. MicroRNA expressionprofiling of single whole embryonic stem cells[J].NucleicAcids Res,2006, 34(2): 1-7.

　　[4] Vivanco I , Sawyers CL. The phosphatidylinositol 3-kinaseAkt pathway in human cancer[J]. Nature Reviews,2002,2(7):489-501.

　　[5] 刘纯,陈述政,范风风,等. 乳腺癌保乳手术68例分析[J].温州医学院学报,2006,36(6):563-565.

　　[6] Hutvagner G. Small RNA asymmetry in RNAi: function inRISC assembly and gene regulation[J]. FEBS Lett, 2005,579(26):5850-5857.

　　[7] Iorio MV, Ferracin M, Liu CG, et al. MicroRNA gene ex-pression deregulation in human breast cancer[J]. Cancer Res,2005,65(16):7065-7070.

　　[8] Scott GK, Goga A, Bhaumik D, et al. Coordinate suppressionof ERBB2 and ERBB3 by enforced expression of micro-RNA miR-125a or miR-125b[J]. J Biol Chem, 2007, 282(2):1479-1486.

　　[9] Alroy I, Yarden Y. The ErbB signaling network in embryo-genesis and oncogenesis: signal diversification through com-binatorial ligand-receptor interactions[J]. FEBS Lett, 1997,410(1):83-86.

　　[10] Brennecke J,Stark A,Russell RB,et al.Principles of microRNA-target recognition[J]. PLoS Biol,2005,3(3): 404-418.