CO2促缺血下肢侧支循环建立的实验研究

　　作者：张昌来　张虎　宋惠民　邵军　吕丽红　尹金岭

　　【摘要】目的：观察经股动脉主射CO2对兔缺血下肢侧支循环形成作用。方法：采用新西兰大白兔，建立兔急性下肢缺血模型。将模型兔分成两组，实验组10条，每日经股动脉注射95%的CO2(2ml/kg);对照组6条，每日只注射与实验组等量的肝素生理盐水，共20d，20d后行血管造影、病理、免疫组化染色检查，评价各组侧支血管形成状况。结果：实验组较对照组动物下肢缺血部位新生血管明显增多，侧支循环形成。结论：CO2能加速扩张下肢动脉侧支血管，加速缺血区动物侧支循环的建立，增加下肢缺血区微血管的密度，改善缺血区的血液供应，并有效的保护下肢功能。

　　【关键词】二氧化碳?侧支循环?腿?缺血

　　Effects of CO2 on the development of collateral circulation within lower limb ischemia

　　ZHANG Changlai1,ZHANG Hu2,SONG Huimin1,SHAO Jun3,LV Lihong3,YIN Jinling3

　　1Department of Cardiac Surgery,Qilu Hospital,3Department of Opration Research,School of Medicine,Shandong University(Jinan 250012,China)

　　2Department of Otolaryngology,Zhangqiu City Hospital(Shandong 250200，China)

　　【ABSTRACT】Objective:Injection of CO2 through femoral artery,the effect of CO2 was studied on the development of collateral circulation in the ischemic lower limb.Methods:Using healthy New Zealand White rabbits,firstly,rabbit model of acute lower limb ischemia was established.The rabbit models were randomized into two groups:experimental group(n=10),control group(n=6).95%CO2(2ml/kg)was given to experimental group every day.Only heparinnormal saline was given to control group as much as experimental group.After 20 days,angiography,pathology and immunohistochemistry were performed to evaluate collateral circulation of ischemic limb.Results:After 20 days,examination showed better collateral circulation in experimental group,and there was a significant increase in the number of angiogenesis vessels in the region of ischemia when compared with control group.Conclusion:CO2 can better dilate the lower limb collateral vessels,accelerate the establishment of the collateral circulation,increase the density of microvascular in the ischemic section,promote the blood supply to ischemic region,and to effectually shield the limb function.

　　【KEY WORDS】Carbon dioxide?Collateral circulation?Leg?Ischemia

　　对脑血管的研究表明，CO2对血管平滑肌有松驰作用。当血液中CO2分压升高，脑的阻力血管舒张，血流量增加，反之脑的阻力血管收缩，血流量减少。CO2主要调节外周小血管，尤其是皮层的小血管等阻力血管对CO2敏感[1]。下肢血管闭塞是一类严重的血管病，特别是远端流出道差或肢体动脉弥漫性病变、多支病变、血管成形术和外科搭桥术后再狭窄者，目前还没有很好的治疗方法。本研究利用动物急性下肢缺血模型，探讨CO2对缺血肢体侧支循环形成及保护作用。

　　1 材料与方法

　　1.1　实验动物

　　随机选择成年健康新西兰大白兔20只，雌雄不拘，体重2.0~3.0kg，购自山东大学医学院动物实验中心。

　　1.2 试剂和仪器

　　试剂盒SABC由武汉博士德生物工程有限公司提供。4F硅胶管的药物泵购自强生医疗器械公司。熊牌200型呼吸机，惠普监护仪，各种麻醉药品及手术包等常用器械。5F Judkins血管造影导管(Cordis公司)。

　　1.3 实验步骤

　　全麻(经耳缘静脉静注氯胺酮6~8mg/kg，维库溴铵0.1mg/lkg)，术中结扎剪断股动脉及其所有分支(腹壁下动脉、股深动脉、旋股外动脉、腹壁浅动脉)，直至动脉和大隐动脉分叉处。经股动脉结扎处远端插入4F连接药泵的硅胶管，药泵埋入兔背部皮下，注入肝素生理盐水(500ml生理盐水加50mg肝素)5ml防凝，成功16只。将16只模型兔随机分成2组：实验组10只，麻醉苏醒后每日自药泵注射95%CO2(2ml/kg)，注射CO2前先向药泵注射肝素生理盐水2ml，感到药泵通畅后再注射CO2，最后注射肝素生理盐水3ml防凝，共20d;对照组6只，每日自药泵只注射与实验组等量的肝素生理盐水。

　　1.4 腹主动脉造影

　　于治疗20d后行腹主动脉插管造影，了解缺血部位侧支循环形成情况。

　　1.5 病理组织学检查

　　以上实验完成后，血管内注射10%氯化钾10ml将动物处死，取股二头肌、内收大肌，生理盐水冲洗干净，按5等份横切，置于10%福尔马林液中固定，每份常规HE染色，随机选取400倍视野进行毛细血管密度计数，共10个视野取均数。免疫组化染色观察侧支循环血管：每份置备厚4μm的组织切片，采用SABC法，判断标准为：小的棕色团，与周围结构分开，管腔直径10μm。用病理图像分析仪计算每视野(200×)中侧支循环血管的数目，10个标本取均数。

　　1.6 统计学处理

　　均采用两个样本均数的显著性t检验、配对t检验，P0.05认为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 动脉造影

　　20d后腹主动脉插管血管造影显示：实验组动物缺血部位新生血管明显增多，侧支循环形成;对照组亦可见到一些新生血管形成，但明显少于实验组。

　　2.2 病理学检查结果

　　术后20d，实验组肌纤维间可见较多的小血管结构，薄壁血管较多。高倍镜下(400×)毛细血管记数(11.11±8.2)条/HP。对照组肌纤维间小血管结构明显减少，高倍镜下毛细血管记数(8.9±6.0)条/HP，两组差异有统计学意义(P0.05)。免疫组化染色肌组织侧支循环观察;高倍镜下(200×)实验组侧支循环血管数量(34.5±5.6)条/HP;对照组侧支循环血管数量(22.4±4.6)条/HP，两组差异有统计学意义(P0.05)。

　　3 讨论

　　CO2是无色、无味、无毒、可被压缩的气体，早已广泛用于临床诊疗中。CO2为脂溶性物质，可直接通过毛细血管壁内皮细胞进行扩散，在组织和血液中的弥散速度较CO2快230倍，CO2进入血管与血管壁广泛接触，在中、小动脉、微血管中迅速弥散并溶解于血液及组织液中，一部分生成碳酸，再解离出氢离子使局部血液及组织中H+浓度略有升高，另一部分与红细胞结合携走，由于CO2进入血管后只是短暂的气体状态，所以不会发生气栓。每次血管内用量为1~2ml/kg无不良反应，而且对全身血生化、血气无明显的影响。

　　肢体动脉闭塞是一种临床常见病、多发病，严重患者疼痛，跛行。调查发现，外周肢体动脉闭塞患者的生活质量指数接近于晚期肿瘤患者。肢体动脉闭塞，至今尚缺乏有效的药物治疗，必须依赖外科手术进行血管重建和搭桥术，而严重远端肢体缺血，尤其合并糖尿病老年患者，往往没有手术治疗的条件，病情严重时不得不截肢。促进梗塞部位新生血管形成，建立侧支循环，改善血液供应，是治疗梗塞性血管病的新策略。

　　正常情况下，下肢动、静脉之间存在许多处于关闭状态的吻合支，当某部位血管狭窄或闭塞时这些吻合支逐渐开放，形成有功能意义的侧支循环。良好的侧支循环在减少肢体缺血和坏死范围、保护肢体功能、改善患者预后等方面有着积极的作用。但也应注意，哺乳动物与人类一样，天然侧支血管的形成远不足以补偿由于血管病变损失的血流。本次研究表明CO2能加速兔下肢缺血肌组织内侧支循环的形成，改善缺血区血液供应，增加缺血区微血管密度。

　　CO2促缺血肌组织侧支循环形成的机理可能有以下几方面：(1)直接作用：高浓度的CO2直接作用于血管壁，可使血管平滑肌电活动减弱或消失，使血管处于扩张、松弛状态，使潜在侧支循环开放增多，血流量增多。侧支循环的微血管扩张，一方面形成跨侧支压力梯度，跨侧支压力梯度进一步使侧支血管扩张，增加侧支血流量;另一方面局部增多的血液，冲击侧支血管壁及侧支循环间的压力梯度使血流加快，形成剪切力，增加了血管内皮生长因子(vascular endothelial guowth factor,VEGF)基因的转录，激活内皮细胞，表达生长因子，促进侧支循环的形成[2，3]。CO2对血管平滑肌的这种作用是通过血管周围的pH值改变，激活细胞膜上的电压依赖性钠泵实现的[4]。(2)H+的作用：高浓度的CO2经股动脉注入缺血肌组织后，可改变局部组织细胞外液的内环境，即H+浓度增加，可刺激血管内皮细胞产生NO，可扩张缺血区血管，调节缺血区血流[5]。另外，NO还能使VEGFmRNA表达上调，有助于VEGF的促血管渗透作用，促进VEGF刺激的血管扩张[6，7]，而VEGF又促进NO的产生，形成正反馈[8，9]，进一步引起VEGF增多，VEGF可通过多条途径刺激侧支血管的产生和发展。本次实验着重探讨了CO2对缺血肌组织侧支循环形成的作用，没有深入研究CO2的作用机理，CO2的作用机理是一个牵涉面广、比较复杂的问题，为了弄清CO2的作用机理，还需进一步做动物实验。

　　根据本次实验，我们设想对下肢动脉闭塞症中不适合常规治疗的病人，是否可以采用适当方法向狭窄的动脉远端缺血肌组织内注射CO2来观察它的临床效果。虽然CO2溶解度大、弥散快、不容易形成气栓，但注射速度快也可有短暂的气体状态，因此临床应用时注射速度应更慢，避免短暂的气体状态对病人造成危险。另外，CO2的用量也应从小量开始，毕竟动物与人类动脉有很大不同。

　　参　考　文　献

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　　[2]Schaper W.New paradigms for collateral vessel growth[J].JBasic Res Cardiol,1993,88(3):193198.

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　　[5]Kelm M,Schrader.Control of coronary vascular tone by nitric oxide [J].J Circ Rec,1990,66(6):15611575.

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　　张昌来,等.CO2促缺血下肢侧支循环建立的实验研究

　　山东大学1齐鲁医院心外科3医学院手术学研究室(山东济南 250012)

　　2山东省章丘市人民医院耳鼻喉科(山东章丘 250200)