端粒酶反义基因对紫杉醇诱导原代胃癌细胞凋亡的增敏作用

　　作者：崔京远　马红　崔秋娟　周东风　山东省青岛市立医院普外科(山东青岛 266011)

　　【摘要】目的：探讨端粒酶反义寡核苷酸(PSASODN)与紫杉醇(TAXOL)联合应用对原代胃癌细胞凋亡作用的影响。方法：常规组织块培养法进行胃癌细胞原代纯化培养，取第3代对数生长期细胞进行实验。各组在培养24h及48h分别加入相同剂量的培养液;终浓度：3μM的PSASODN,3μM的NASODN，10μM的TAXOL。作用24h后再分别在PSASODN组及NASODN组加入终浓度为10μM的TAXOL;分别于培养后24，48，72，96h收集各组细胞。以台盼蓝拒染法计算各组细胞生长抑制率，观察PSASODN联合TAXOL对原代胃癌细胞生长的影响;流式细胞学观察细胞凋亡率及细胞周期变化。结果：终浓度为3μM的PSASODN作用于原代胃癌细胞24h后加入TAXOL10μM，能明显抑制胃癌细胞增殖，同时流式细胞学检测到凋亡峰，细胞受阻于G2/ M期，作用48，72，96h的凋亡细胞百分率(348%，446%及506%)明显高于TAXOL组及NASODN+TAXOL组，差异有统计学意义(P<005)，其作用呈时间依赖性及序列特异性。结论：以端粒酶RNA模板区为靶点的PSASODN可促进TAXOL诱导的胃癌细胞凋亡，对胃癌具有重要治疗价值。

　　【关键词】端粒，末端转移酶?寡核苷酸类，反义?紫杉醇?胃肿瘤?细胞凋亡

　　Study on effect of apoptosis induced by telomerase antisense oligodeoxynucleotides and TAXOL in primary human gastric cancer cells

　　CUI Jingyuan,MA Hong,CUI Qiujuan,ZHOU Dongfeng

　　Department of General Surgery,Qingdao Municipal Hospital(Qingdao 266011,China)

　　【ABSTRACT】Objective:To study the effect of apoptosis induced by telomerase antisense oligodeoxynucleotides(PSASODN) and TAXOL in primary human gastric cancer cells.Methods:Primary Gastric cancer cells were purified by tissue culture method.The third generation cells were used in this experiment.After incubation for24 hours and 48 hours,cells were treated with PSASODN of 3μM,NASODN of 3μM and TAXOL of 10μM respectively.After incubation for 24 hours,TAXOL of 10μM was added to group PSASODN and NASODN.Cells were continued to incubate for 48,72 and 96 hours.inhibiting rate was determined by trypan blue.Flow cytometry was adopted to examine apoptotic rate and cell cycle.Results:Treatment with TAXOL after 24 hours of exposure of cells to 3μM PSASODN inhibited significantly the growth of primary human gastric cancer cells.The apoptotic peak was detected with FCM and cells were blocked in G2/ M stage.The percentage of apoptotic cells treated with TAXOL from 48 hours to 96 hours after 24 hours of exposure to PSASODN (34.8%,44.6%and 50.6%) was higher than that of cells treated with NASODN plus TAXOL or TAXOL alone(P<005).The effect was in time dependent and sequence specifice manner.Conclusion:PSASODN targeted hTR could increase the TAXOLinduced apoptosis of primary gastric cancer cells.Therefore it may be a new target to gastric carcinoma therapy.

　　【KEY WORDS】Telomerase?Oligodeoxynucleotides,antisense?TAXOL?Stomach neoplasms?Apoptosis

　　端粒酶是目前已知最具特异性和普遍性的恶性肿瘤标志物。近年来研究发现，端粒酶在胃癌组织中高表达，而人端粒酶RNA(hTR)的表达甚至早于端粒酶的激活[1，2]。抑制端粒酶活性已成为治疗恶性肿瘤的新途径[3，4]。互补于hTR模板区的反义寡核苷酸(PSASODN)不但抑制人胃癌细胞端粒酶活性，而且明显抑制胃癌细胞的增殖[5]。在此基础上，本文进一步探讨PSASODN对紫杉醇(TAXOL)诱导的原代培养胃癌细胞凋亡的影响，旨在开辟一条治疗胃癌的新途径。

　　1 材料和方法

　　11标本资料

　　患者男，65岁，胃手术切除标本经病理证实为低分化腺癌，TNM分期Ⅲb期，无任何化疗史。

　　1.2药品和试剂

　　RPMI1640培养基为GIBCO产品;PSASODN序列为5'CTCAGTTAGGGTTAGACA3'，对照寡核苷酸(NASODN)序列为5'CATTTCTTGCTCTCCACG3'，均为全硫代修饰型，由上海生物工程公司合成。碘化丙啶为Sigma公司产品。TAXOL为澳大利亚科鼎公司产品，使用时以RPMI1640稀释至所需浓度。

　　1.3　方法

　　131 取材

　　在手术切除后1~3h内，严格无菌条件下从瘤体生长活跃、无坏死变性的边缘部位多点取材，细心去除周围脂肪、结缔组织、血块及坏死物，用酸性离子水反复冲洗至外观较透明、呈鱼肉状，有质感及弹性，体积约15~25cm3，置预先备好的装有DHank液的无菌小瓶内。

　　132原代胃癌细胞培养

　　在层流超净工作台上，用RPMI1640培养液(含20%胎牛血清，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素及2%HEPES缓冲液)漂洗标本2次，剪成约1mm3，置37℃、5%CO2培养箱内，饱和湿度下，采用常规组织块培养法进行胃癌细胞原代纯化培养，取第3代对数生长期细胞用于实验。

　　1.3　3 实验步骤

　　本实验设空白对照组，TAXOL组，PSASODN+TAXOL组，及NASODN+TAXOL组。采用24孔培养板，每组设3个复孔，细胞接种浓度为5×105/ml，各组在培养24及48h分别加入相同剂量的培养液;终浓度为3μM的NASODN;终浓度为3μM的PSASODN;终浓度为10μM TAXOL。作用24h后再分别在PSASODN组及NASODN组加入终浓度为10μM TAXOL;继续于培养24，48，72，96h，收集细胞以台盼蓝拒染法计算各组细胞生长抑制率。收集4组各时段细胞数各106个，70%酒精固定24h，冷PBS洗涤3次，离心后弃上清，碘化丙啶05ml重悬细胞，室温下避光染色30min，在流式细胞仪上测试细胞周期和细胞凋亡率。

　　134统计学方法

　　所得数据用x±s表示，采用SPSS100统计学软件进行分析，以P<005为差异有统计学意义。

　　2　结果

　　2.1PSASODN联合TAXOL对原代培养胃癌细胞增殖的影响

　　PSASODN作用胃癌细胞24h后加入TAXOL，倒置显微镜下观察，发现细胞变圆漂起，生长缓慢，有的细胞体积缩小，细胞内颗粒增多。台盼蓝拒染法计数活细胞并计算细胞生长抑制率，发现PSASODN+TAXOL组对胃癌细胞生长具有明显的抑制作用，抑制率与空白对照组、TAXOL组及NASODN+TAXOL组相比，差异有统计学意义(P<005)，并随时间延长而增强;NASODN+TAXOL组与TAXOL组相比，差异无统计学意义(P>005)(图1(略))，提示PSASODN+TAXOL对胃癌细胞的生长抑制作用具有时间依赖性及序列特异性。

　　2.2 各组凋亡细胞百分率

　　3μM的PSASODN+TAXOL作用胃癌细胞后，流式细胞学检测结果表明细胞受阻于G2/M期，并检测到典型的凋亡峰，作用48，72，96h的凋亡细胞百分率分别为351%，457%及506%，与TAXOL组及NASODN+TAXOL组相比，差异有统计学意义(P<005);而NASODN+TAXOL组与TAXOL组相比，差异无统计学意义(P>005)(表1)。表14组原代胃癌细胞凋亡率比较(略)

　　3讨论

　　端粒端粒酶系统异常与细胞衰老、永生化及恶性肿瘤的形成有密切关系。而且人端粒酶hTR的表达甚至早于端粒酶的激活。因此，hTR的表达和端粒酶激活被认为是人胃癌发生的早期事件。有研究表明，针对hTR的端粒酶抑制剂对癌细胞有明显作用，如使端粒缩短，降低逆转录酶活性可使裸鼠移植瘤体积缩小[6，7]。端粒酶活性抑制剂有希望成为最有前途的抗癌药物。

　　胃癌是消化系统常见恶性肿瘤，发病率及死亡率均高，由于临床缺乏特异性症状和体征，早期诊断率很低，中、晚期患者除手术及放疗外，化疗仍是胃癌治疗的主要手段。紫杉醇是从紫杉树皮中提取的一种抗肿瘤药物，它与传统的抗癌药不同，它不影响癌细胞的DNA及RNA合成，也不损伤DNA分子，而是选择性地作用于微管蛋白/微管系统，促进微管聚合，抑制微管降解，从而影响纺锤体的功能，抑制癌细胞的有丝分裂，使细胞分裂阻滞在G2/M期，最终导致细胞死亡[8]。

　　本研究结果表明，互补于hTR模板区的PSASODN作用于原代培养胃癌细胞后，再应用TAXOL，可明显抑制胃癌细胞的生长，同时流式细胞学检测表明，作用48,72,96h的胃癌凋亡细胞百分率明显增加，其作用呈时间依赖性及序列特异性。与TAXOL组及NASODN+TAXOL组相比，有显著性差异。以上结果提示PSASODN可显著增强胃癌细胞对紫杉醇诱导凋亡的敏感性。其机制可能是：①PSASODN封闭了hTR模板区，阻止端粒酶合成端粒，从而破坏了染色体DNA的结构，使之更易于受到损伤;②端粒长度的维持及染色体的稳定是凋亡的抑制因素，而端粒的缩短则可触发凋亡诱导剂诱导细胞凋亡[9]，故PSASODN对端粒DNA的抑制作用无疑加强了TAXOL的作用，加速胃癌细胞凋亡，而NASODN则无上述作用。③凋亡相关基因的直接调控。大量研究证实，许多基因参与了凋亡过程的调控，如p53、bcl2及cmyc等均为细胞凋亡通路中的重要调节基因，其中bcl2是目前公认的凋亡抑制基因，其表达上调时细胞凋亡受抑制。因此深入研究其与细胞凋亡及端粒酶活性之间的关系，有重要意义。

　　本研究结果显示PSASODN可显著增强胃癌细胞对TAXOL诱导凋亡的敏感性，提示PSASODN联合TAXOL对胃癌可能具有潜在治疗价值。

　　参 考 文 献

　　[1]Furugori E,Hirayama R,Nakamura KI,et al.Telomere shortening in gastric carcinoma with aging despite telomerase activation[J].J Cancer Res Clin Oncol,2000,126(8):481485.

　　[2]Hur K,Gazdar AF,Rathi A,et al.Overexpression of human telomerase RNA in Helicobacter pyloriinfected human gastric mucosa[J].Jpn J Cancer Res,2000,91(11):11481153.

　　[3]Yoo J,Park SY,Kang SJ,et al.Expression of telomerase activity,human telomerase RNA,and telomerase reverse transcriptase in gastric adenocarcinomas[J].Mod Pathol,2003,16(7):700707.

　　[4]亓玉琴,刘吉勇,朱菊人,等.反义寡核苷酸转染对SGC7901胃癌细胞端粒酶活性及细胞凋亡的影响[J].临床内科杂志,2002,19(4):278280.

　　[5]Kondo Y,Komata T,Kondo S,Combination therapy of 25A antisense against telomerase RNA and cisplatin for malignant gliomas[J].Int J Oncol,2001,18(6):12871292.

　　[6]Kiyozuka Y,Yamamoto D,Yang J,et al.Correlation of chemosensitivity to anticancer drugs and telomere length,telomerase activity and telomerase RNA expression in human ovarian cancer cells[J].Anticancer Res,2000,20(1A):203212.

　　[7]Buttitta F,Pellegrini C,Marchetti A.Human telomerase reverse transcriptase mRNA expression assessed by realtime reverse transcription polymerase chain reaction predicts chemosensitivity in patients with ovarian carcinoma[J].J Clin Oncol,2003,21(7):13201325.

　　[8]Roussel E,Belanger MM,Couet J.G2/M blockade by paclitaxel induces caveolin1 expression in A549 lung cancer cells:caveolin1 as a marker of cytotoxicity [J].Anticancer Drugs,2004,15(10):961967.

　　[9]Wong G SC,Yu H,Moochhala SM,et al.Antisense telomerase induced cell growth inhibition,cell cycle arrest and telomerase activity downregulation in gastric and colon cancer cells[J].Anticancer Res,2003,23(1A):465469.

　　崔京远，等端粒酶反义基因对紫杉醇诱导原代胃癌细胞凋亡的增敏作用