结直肠癌组织中CyclinB1、p34cdc2、PCNA和Ki67表达的研究

　　作者：边月红 马晓丽 黄淑红 黄敬爱 翟永华 谢经武 张红卫

　　【摘要】目的：探讨结直肠癌发生和分化中CyclinB1、p34cdc2、PCNA和Ki67表达异常及其临床病理学意义。方法：采用免疫组化SABC法检测CyclinB1、p34cdc2、PCNA和Ki67在16例结直肠癌组织中蛋白的表达。结果：CyclinB1和p34cdc2染色定位于细胞胞浆和(或)胞核内。PCNA和Ki67染色定位于胞核内。在研究病例中有87.5%(14/16)CyclinB1阳性表达，81.2%(13/16)p34cdc2阳性表达，93.7%(15/16)PCNA阳性表达，81.2%(13/16)Ki67阳性表达。低分化结直肠癌的CyclinB1、p34cdc2、PCNA和Ki67阳性率明显高于高中分化结直肠癌，CyclinB1、p34cdc2、PCNA和Ki67的表达具有高度一致性。结论：CyclinB1、p34cdc2、PCNA和Ki67的阳性表达率及表达强度同结直肠癌分化程度有密切关系。

　　【关键词】结直肠肿瘤?增殖细胞核抗原?CyclinB1?p34cdc2?Ki67

　　Expression of CyclinB1,p34cdc2,PCNA and Ki67 in colorectal carcinogenesis

　　BIAN Yuehong,MA Xiaoli,,HUANG Shuhong,HUANG Jingai,ZHAI Yonghua,XIE Jingwu,ZHANG Hongwei

　　1Institute of Development Biology,School of Life Science,Shandong University (Jinan 250100,China)

　　2Department of Surgery,Qilu Hospital of Shangdong University (Jinan 250012,

　　China)

　　3Center Laboratory of Jinan Central Hospital,Clinical Medical College of Shandong　University (Jinan 250013,China)

　　4Department of Phamacology and Toxicology,University of Texas Medical Branch

　　(Galveston 775551048 USA)

　　【ABSTRACT】Objective:To research the clinicopathological significance of CyclinB1,p34cdc2,PCNA and Ki67 in colorectal carcinogenesis.Methods:The expression of CyclinB1,p34cdc2,PCNA and Ki67 was examined by SABC immunohistochemical technique in colorectal carcinogenesis.Results:Immunoreaction to CyclinB1 and p34cdc2 was mainly localized in the cytoplasm or nuclear of cells.Expression of PCNA and Ki67 was localized in the nucleus. The postive immunostaining rate of CyclinB1,p34cdc2,PCNA and Ki67 was 87.5%,81.2%,93.7% and 81.2%,respectively.CyclinB1,p34cdc2,PCNA and Ki67 positive rates in poorly differentiated colorectal carcinoma were much higher than those in well differentiated colorectal carcinoma. Conclusion:CyclinB1,p34cdc2,PCNA and Ki67 play a certain role in the development of colorectal carcinoma,and as malignant degree of colorectal carcinoma increases,their positive rates and grades will be higher.

　　【KEY WORDS】Colorectal neoplasm?Proliferationg cell nuclear antigen?CyclinB1?p34cdc2?Ki67

　　绝大多数恶性肿瘤细胞都存在遗传物质和(或)细胞周期检测点的异常。CyclinB1/p34cdc2复合物是G2/M期转换的关键调控分子，增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclesr antigen,PCNA)和Ki67多用于判断肿瘤的良恶性以及恶性程度，也用于探讨细胞增殖活性、细胞周期与肿瘤生长方式、浸润方式、复发、转移等生物行为及预后的关系。本文通过对16例手术切除的结直肠原癌组织进行免疫组化研究，探讨CyclinB1、p34cdc2、PCNA和Ki67在结直肠癌组织中的表达的意义和它们之间的相关性。

　　1 材料方法

　　1.1 材料2002~2004年收集山东大学齐鲁医院手术切除并经病理确诊的结直肠癌组织标本16例。其中低分化腺癌组织标本3例，高、中分化腺癌组织标本13例。所有病例手术前均未经任何放疗、化疗。

　　1.2 主要试剂即用型鼠p34cdc2单克隆抗体(浓缩液)和即用型鼠CyclinB1单克隆抗体(工作液)及ABC试剂盒购于武汉博士德公司。PCNA(浓缩液)和Ki67(浓缩液)购于北京中杉金桥生物技术有限公司。

　　1.3 CyclinB1、p34cdc2、PCNA和Ki67检测方法经4%多聚甲醛固定、石蜡包埋标本，常规组织学切片，分别进行HE和免疫组织化学染色。免疫组化法：石蜡切片经二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化。用体积分数3%H2O2孵育20min消除内源性过氧化物酶活性。抗原修复：将切片置于10μg/ml的皂素(saponin)溶液室温孵育30min(或煮沸法修复抗原)。其余步骤按常规免疫组化SABC法进行，DAB显色液显色，苏木素复染，树脂封片。实验对照采用SABC法，以PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照。

　　1.4 结果判定光镜下每张切片在结直肠癌组织中随机选取高倍视野计数500个细胞，以出现棕黄色颗粒者为阳性细胞。根据阳性细胞数判断结果：阴性(-)：无阳性细胞或阳性细胞数10%，阳性(+)：10%≤阳性细胞数≤25%;阳性(++)：阳性细胞数25%。

　　2 结果

　　2.1 CyclinB1、p34cdc2、PCNA和Ki67在结直肠癌组织中的表达在结直肠癌组织中，PCNA和Ki67的表达定位于细胞核内(图1B，C(略))。CyclinB1和p34cdc2的表达多定位于细胞质中，少数同时定位于细胞核和细胞质中(图1E，F，H(略))。

　　由表1可见，在结直肠癌组织中，PCNA和Ki67的阳性表达率分别为93.7%(15/16)、81.2%(13/16)，CyclinB1和p34cdc2的阳性表达率分别为87.5%(14/16)、81.2%(13/16)。其中CyclinB1、p34cdc2、PCNA和Ki67共有13例共同阳性，1例共同阴性。经统计学分析，CyclinB1、p34cdc2、PCNA和Ki67表达具有一致性(P0.01)

　　2.2　CyclinB1、p34cdc2、PCNA和Ki67在不同分化程度的直肠癌组织中的表达CyclinB1和p34cdc2在高、中分化结直肠癌中阳性表达率分别为84.6%(11/13)、76.9%(10/13)，在低分化中均为100%(3/3)表达。PCNA和Ki67在高、中分化结直肠癌中阳性表达率分别为92.3%(12/13)、76.9%(10/13)，在低分化结直肠癌中均为100%(3/3)表达。见表1。表1 CyclinB1、p34cdc2、PCNA和Ki67在不同分化程度结直肠癌中的表达(略)

　　3 讨论

　　细胞周期由G1→S→M期的进展需要一些起始和终止信号调控。调控细胞周期按序进行的控制点(即检查点)通常是指G1/S期检查点、G2/M期检查点以及有丝分裂检查点。G2/M期转换的关键调控分子是CyclinB1/p34cdc2复合物。CyclinB1是典型的G2/M期周期素，在G1期水平很低，在S期和G2期逐渐升高，在G2/M期达高峰，并与p34cdc2形成复合物称为有丝分裂促进因子(mitosis promoting factor,MPF)。MPF的活性在有丝分裂过程中达高峰，并将关键蛋白磷酸化，从而完成有丝分裂。研究发现CyclinB1和p34cdc2过表达与乳腺癌有丝分裂指数和增殖指数有关，干预G2/M调控，促进细胞的异常分裂增殖[1，2，3]。去除CyclinB1可以抑制肿瘤细胞的增殖，诱导肿瘤细胞的凋亡[4]。本实验显示CyclinB1和p34cdc2在结直肠癌中定位于细胞胞浆和(或)胞核内，并且随着分化程度的降低，阳性表达率呈递增趋势，提示CyclinB1和p34cdc2与结直肠癌的增殖密切相关，可为肿瘤诊断提供帮助。

　　PCNA是增殖期细胞特异性表达的核蛋白，主要作为DNA多聚酶δ的辅助因子参与DNA主链的复制和修复。PCNA的表达反映细胞正处于活跃的增殖状态。Bianchi等[5]发现，PCNA阳性细胞的多少能反映肿瘤生长的速度，细胞分化程度愈低，增殖速度愈快。PCNA作为恶性肿瘤的预后因子，在多种肿瘤如肾细胞癌[6、7]、乳腺癌[8]、咽癌[9]、胃癌[10]中应用。Ki67的表达与细胞周期密切相关，与乳腺癌[11]、脑胶质瘤[12]、肾癌[13]、胃癌[14]及宫颈癌[15]等恶性肿瘤的组织学分级、肿块大小、淋巴结转移、术后复发率和死亡率等呈显著正相关。本研究表明，PCNA和Ki67在结直肠癌中均随分化程度的下降，阳性表达率呈递增趋势。提示PCNA和Ki67与结直肠癌的增殖密切相关，检测PCNA和Ki67的表达水平，有助于结直肠癌恶性程度和预后的判断，对指导临床治疗有一定意义。所表达的增殖信息各有特点，PCNA在G1期有表达，代表的增殖信息较为全面;Ki67在G1期基本不表达，使增殖信息有所损失，故对二者在结直肠肿瘤细胞中表达的评价以及良、恶性肿瘤界定值还需要进一步研究。

　　综上所述，CyclinB1、p34cdc2、PCNA和Ki67在结直肠癌的增殖中起重要作用，对判断其恶性程度及临床治疗提供了一个重要指标。

　　参 考 文 献

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　　[3]Katherine LB,Barrett,Donna Demiranda,et al.CyclinB1 promoter activity and functional in G1 phase of human breast cancer cells[J].Cell Int,2002,26:1928.

　　[4]Juping Yuan,Ruilan Yan,Andrea Krmerl,et al.CyclinB1 depletion inhibits proliferation and induces apoptosis in human trmor cells[J].Oncogene,2004,23:58435852.

　　[5]Bianchi S,Paglierani M,Zampi G,et al.Prognostic value of proliferating cell nuclear antigen in lymph nodenegative breast cancer patients[J].Cancer,1993,72(1):120125.

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　　[13]吴伟成，赵一鸣.肾癌细胞Ki67免疫组织化学染色指数预后的关系[J].肿瘤防治研究，1998，25(3)：178180.

　　[14]李平，黄昌明，张祥福，等.DcR3和Ki67在胃癌的表达及临床意义[J].福建医科大学学报，2004，38(1)：3942.

　　[15]林岷，江忠清，游彩玲，等.Ki67抗原在宫颈癌的表达和临床意义[J].中国现代医学杂志，2003，13(12)：911.

　　[基金项目]国家自然科学基金B类资助项目(30228031)

　　[作者简介]边月红(1981-)，女，山东淄博市人，硕士研究生。研究方向：肿瘤发生机制的研究。Tel:(0531)88364935 Email:bianyuehong@yahoo.com.cn

　　[通讯作者]张红卫，联系地址：山东大学生命科学院发育生物学研究所(250100) Tel:(0531)88364935 Email:zhw@sdu.edu.cn

　　谢经武，联系地址：University of Texas Medical Branch(775551048) Tel:(409)7471935 Email:jingwu@utmb.edu

　　边月红，等.结直肠癌组织中CyclinB1、p34cdc2、PCNA和Ki67表达的研究

　　1山东大学生命科学学院发育生物学研究所(山东济南250100)

　　2山东大学齐鲁医院普外科(山东济南250012)

　　3山东大学临床医学院济南中心医院中心实验室(山东济南250013)

　　4Department of Phamacology and Toxicology,University of Texas Medical Branch (Galveston 775551048 USA)