自杀基因疗法治疗乳腺癌研究进展

　　作者：盛新华　卿三华 　南方医科大学南方医院 普通外科 (广东 广州 510515)

　　【关键词】自杀基因?乳腺肿瘤?基因疗法

　　乳腺癌除手术切除外，迄今尚无满意的治疗措施，但手术根治切除率低。自杀基因(suicide gene)疗法的出现，为乳腺癌的治疗提供了一种较为有效和具有临床应用潜力的治疗策略。本文就自杀基因治疗乳腺癌的研究进展作一综述。

　　1 自杀基因疗法的机制

　　1.1 直接杀伤作用 即转染了前药转换酶基因的肿瘤细胞能将前药转变成细胞毒物质，从而直接杀伤肿瘤细胞。1986年Moolten[1]应用逆转录病毒将TK基因导入肿瘤细胞，被转导的肿瘤细胞(TK+)对丙氧鸟苷(ganciclovir,GCV)高度敏感。GCV是一种核苷酸类似物，在TK作用下形成一磷酸丙氧鸟苷，然后再转化为三磷酸丙氧鸟苷，作为链终止剂，干扰肿瘤细胞分裂时DNA的合成，最终导致细胞分裂阻抑或死亡。因此，肿瘤细胞内前体药物毒性产物的高浓度淤积，发挥了细胞毒杀伤作用。

　　1.2 旁观者效应(bystander effect) 在Moolten还观察到，TK+与TK-肿瘤细胞以一定比例混合时，在GCV的作用下，TK-肿瘤细胞几乎全被杀死。转染了自杀基因的肿瘤细胞被杀死，其周围大量未被转染的细胞也被杀死的现象称为旁观者效应。旁观者效应明显扩大了自杀基因的杀伤作用。由于基因载体系统在体内的转染效率很低，自杀基因在体内对肿瘤直接杀伤作用比较小，因而旁观者效应起着十分重要的作用。

　　近年来还发现，相距甚远的两个肿瘤也可以发生旁观者效应，即一个表达了TK基因的肿瘤受GCV处理而萎缩时，另一未被转染表达TK基因的肿瘤也同样萎缩，称之为远距离旁观者效应(distant bystander effect)[2]。

　　2 目前研究的乳腺癌自杀基因体系

　　目前用于乳腺癌治疗的自杀基因体系主要有以下几种：

　　2.1单纯疱疹病毒胸苷激酶(herpes simplex virusthymidine kinase,HSVTK)基因/更昔洛韦(GCV)系统 GCV是阿昔洛韦的衍生物，在HSVTK的作用下转化为单磷酸GCV，继而在哺乳类动物细胞激酶的共同催化下转化为细胞毒物质三磷酸GCV。它可与NTP竞争DNA多聚酶的结合位点，阻止单链DNA的延长，使细胞周期停滞在S期，抑制细胞分裂。而Haberkorn等[3]则认为，GCV并非HSVTK的理想底物。

　　2.2 大肠杆菌胞嘧啶脱氨基酶(escherichia coli cytocine deaminase,CD)基因/5氟胞嘧啶(5flurocytosine,5FC)系统 CD仅存在于细菌或真菌中，哺乳类动物细胞缺乏这种酶。该酶可使5Fc转化为5氟尿嘧啶(5Fu),继而形成单磷酸5氟脱氧尿苷(5FdUMP)。5FdUMP是一种不可逆的胸腺嘧啶核苷酸合成酶抑制剂，使脱氧核苷三磷酸合成受阻从而抑制DNA的合成

　　2.3 水痘带状疱疹病毒胸苷激酶(varicella zoster virus thymidine kinase,VZVTK)基因/5(2溴乙烯)2脱氧尿苷(BVDU)系统 GrignetDebrus等[4]的实验表明，VZVTK可作为一个自杀基因，但要以BVDU作为前药。BVDU三磷酸盐可结合到DNA链中，诱使单链断开。但BVDU活化后的主要细胞毒性在于阻止细胞内胸核苷酸的合成，便脱氧尿苷(dUMP)转化成脱氧胸苷(dTMP)。

　　2.4 surfacetethered bacterial CPG2[stCPG2(Q)3]基因/4[(2chloroethyl)(2mesyloxyethyo)amino]benzoylLglutamic acid(CMDA)系统 CPG2能将CMPA水解产生苯甲酸、苯酚和苯胺氮芥，或能过自溶反应产生蒽环类抗肿瘤药，它的最大优点是产生的细胞毒物质为细胞周期非特异性药物。免疫组化试验显示，即使在仅含有很小一部分stCPG2(Q)3表达的细胞中，在前药CMDA治疗下，大部分细胞凋亡，提示存在着巨大的旁观者效应[5]而Freiddlos等[6]的研究显示，4N二碘乙基苯氧羰基石氨酸(4[bis(2iodoerhyl)amino]phenyloxycarbonyLglutamic acid)、3氟4N二氯乙基苯甲酰谷氨酸(3fluoro4[bis(2chlorethyl)amino]benzoylLglutamic acid)及3，5二氟4N二碘乙基苯甲酰谷氨酸(3，5difluoro4[bis(2iodoethyl)amino]benzoylLglutamic acid)这三种药物作为前药比CMDA更为有效(抗肿瘤活性是CMDA的19~27倍)。

　　3 转染自杀基因体系的载体选择

　　用于转染自杀基因体系的载体包括病毒载体和非病毒载体。病毒载体由于具有高效、血清滴度高、容量大、低毒、易于分离等优点而成为基因治疗中应用最为广泛的载体。

　　逆转录病毒载体[7、8]是目前研究最多、最为成熟的载体，感染效率高，能持续表达，可以把外源基因以前病毒的形式转移到靶细胞基因组中，但其携带外源基因的容量较小，且感染特异性不高，只能转导分裂细胞，重组病毒的滴度较低，不造于治疗大肿瘤。另外，它可被血浆中的补体灭活，也有引起异常突变和激活癌基因的可能。

　　腺病毒载体是近年来常用的载体。重组腺病毒可有效地将外源基因转移并表达于多种细胞中，感染效率高，可携带的基因较大，致死性和致瘤性低，使用安全。腺病毒介导的基因转染在乳腺癌中显示出极高的基因转染效率[9]。但也有其缺点：治疗基因为随机的非特异性转染;病毒抗原可诱导机体产生免疫反应，限制了重复使用;重组腺病毒可导致转染细胞毒性及细胞死亡，使基因表达时间受限;对肝细胞有损伤作用。

　　其他可用于基因转导的载体还有腺相关病毒载体、脂质体等。

　　4 增强基因转导效率的启动子的选择

　　应用自杀基因疗法时，基因靶向性是影响整个基因治疗成功与否的主要障碍。利用乳腺肿瘤组织特异性的调控元件去调节自杀基因的表达是一种较为有效的办法[9]。目前研究的启动子主要有以下几种。

　　4.1EGR1启动子 EGR1启动子为早期生长反应因子1(early growth response factor1)基因上游约550/50bp的一顺式作用元件，其活性受控于一些诱导剂，如电离辐射。联合EGR1启动子与自杀基因，用辐射能在肿瘤局部从时、空调控治疗基因的表达，使其产物局限于肿瘤局部，并发挥放疗的杀伤肿瘤效应。

　　4.2 人源erbB2基因启动子[10、11] erbB2肿瘤基因在约20%～35%的乳腺癌病人中有过度的表达。它的上调与乳腺肿瘤对化疗及放疗的不敏感有关，并与不良预后相关。Maeda等[12]的研究发现，将包含有HSVTK及erbB2基因启动子(P256TK)的质粒转染乳腺癌细胞后，乳腺癌细胞对GCV的敏感性增强，肿瘤生长受抑。

　　4.3 hALA(human alphaLactalbumin)gene/oBLG(ovine betaLactoglobulin)gene[9、13] 乳腺癌抗原(hALA)在超过60%的乳腺癌中有表达。在分娩过程中，hALA水平急剧增加，分娩后数周开始下降。因这一蛋白产物具有乳腺特异性，它的上游调节序列被常规应用于介导转基因鼠乳腺细胞异源基因的表达。oBLG蛋白是一种在反刍动物乳汁中含量最丰的乳清蛋白。它的激素依赖性调节方式与hALA相似。功能分析显示，近端序列中406bp在转基因小鼠中具有乳腺组织特异性。也有作者报告，hALA 、oBLG组织特异性表达的近端序列中含有相似的成分，这一成分能与乳腺特异性转录因子结合。Anderson等的实验表明，hALA或oBLG启动子能诱使HSVTK基因在乳腺癌细胞的靶向性表达。

　　4.4 grp78promoter[7] 在体外，grp78promoter能诱导自杀基因在肿瘤细胞内的表达。在体内，grp78promoter促进HSVTK基因在肿瘤组织内的表达，投予GCV后，引起肿瘤全部消失。然而，当HSVTK基因受逆转录病毒LTR作用时，肿瘤却耐受，因此，grp78promoter有益于增强抗瘤效应。

　　4.5 Heatshock protein(HSP)promoter[14、15] HSP启动子活性在热休克后(41～45℃)显著增强，3h达到最高，体外细胞毒性测定显示HSPTK转导的FM3A细胞株对GCV更敏感(50000倍)。除启动子介导选择性细胞杀伤外，免疫组化分析显示这种协同杀伤效应部分依赖于Fas和FasL基因的上调所致的细胞的凋亡。体内肿瘤的显著缩小还见于HSPTK转导并继以热疗的肿瘤组织，而在模拟载体感染或热疗的肿瘤中则不发生肿瘤的抑制。

　　4.6 翻译起始因子(translation initiation factor,elF4E)[16] elF4E常在实体肿瘤中过度表达。它的升高使mRNA足够翻译，而在正常情况下，由于其5’端非翻译区而受抑，这种mRNA编码生长促进蛋白。这一发现被用于在翻译水平调节HTK(herpes simplex virus typeI thymidine kinase,HTK)的合成，选择性杀伤癌细胞。多种乳腺癌细胞株可以通过翻译调节mRNA有效合成HTK，而在正常细胞则没有。

　　4.7 Midkinepromoter(MK) YU等[11]检测了18例乳腺癌患者MK及cerbB2在肿瘤及与之配对的非肿瘤标本中的表达，结果发现，MK及cerbB2基因在非肿瘤区域中的表达都比较低，且两者之间没明显差异。相反，在肿瘤标本中，MK及cerbB2基因分别在18例、6例病人中上调。MK基因调节区域在激活人乳腺癌细胞株报告基因上与cerbB2相似。转染有MKpromoter或cerbB2promoter HSVTK的乳腺癌细胞均对GCV敏感。而MKpromoter在激活乳腺癌治疗基因上较cerbB2启动子更为有效。

　　4.8 TetOn调节系统胡维新等[8]建立了一种较为理想的逆转录病毒载体系统，包含有HSVTK基因和TetOn调节系统。利用RevTetOn基因表达系统将自杀基因转染到人乳腺癌细胞株MCF7并对TK基因的表达进行调控。结果表明，HSVTK基因的表达受控于TetOn，在强力霉素存在的情况下，TetOn系统开启，基因表达被激活。

　　5 乳腺癌自杀基因疗法的临床应用

　　5.1 临床试验Pandha等[10]对12例有erbB2过渡表达的乳腺癌病人进行了Ⅰ期临床试验。通过在肿瘤内直接注射重组有erbB2启动子片段、CD基因和前药5FC的质粒进行治疗，90%的病人目的基因表达阳性，自杀基因的显著表达抑制了erbB2阳性的肿瘤细胞，从而证实了这种治疗方法的靶向性，并且是安全的。

　　5.2 与免疫反应的联合应用自杀基因治疗使肿瘤微环境由免疫抑制向免疫刺激转变，而且被杀伤的携带细胞因子基因的肿瘤细胞又可作为疫苗进一步激发机体的免疫功能，从而达到根治肿瘤的目的[17]。目前与自杀基因联合应用的免疫基因有IL2、IFNa及粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)等[18]。有作者联用HSVTK基因、CMCSF、IL2、GCV治疗转移性乳腺癌[19]，取得较好效果。

　　5.3 与放射治疗的结合 自杀基因体系与放疗的结合可增强肿瘤细胞对放疗的敏感性，并且基因启动子在临床剂量离子射线激活下，可对治疗基因的表达产生适当的调控。Scott等[20]的实验表明，给予单剂量1～5Gy的射线，在前药GCV存在情况下，显示出显著的抑瘤效应。

　　5.4 联合自杀基因体系由于不同类型肿瘤细胞对不同酶/前药体系的敏感性存在差异，而且肿瘤患者体内往往同时存在多种克隆肿瘤细胞，因此应用单一酶/前药体系难以达到根治肿瘤的目的。而CDTK双自杀基因疗法可能克服这一缺点[2124]。利用两种酶的互补性可大大提高疗效，加上5FdUMP为细胞通透性的药物，三磷酸GCV为细胞非通透性药物，两者的合用可同时在细胞内、外起到杀伤肿瘤细胞作用，增强旁观者效应。

　　6 结 语

　　乳腺癌自杀基因疗法是一种全新的治疗手段，具有传统疗法所不具备的优越性。但目前的大部分研究仍处于实验阶段，诸多问题需要加以解决，如载体系统的选择，需要考虑病毒载体的危险性、转染的有效性等问题，因此为加强基因治疗的靶向性，开发出既安全又高效的新的载体系统应成为我们的研究方向;在前药的选择上，要考虑到酶活性、用药剂量、用药时间及更安全有效的前药以期达到最佳临床治疗效果;进一步研究自杀基因系统和机体免疫系统的相互作用机制，在转基因杀伤肿瘤的基础上，进一步激活和增强机体强大而持久的抗肿瘤免疫。

　　参 考 文 献

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　　盛新华.自杀基因疗法治疗乳腺癌研究进展

　　[基金项目]广东省自然科学基金资助项目(032902)