大肠癌肝微转移预测的研究现状

　　作者：陈磊， 周东风，林惠忠， 郝林华，寿楠海

　　[作者简介]陈磊(1971.9-)，男，医学硕士，主要从事胃肠道肿瘤的研究。Tel:(0532)84091758 Email:chenlei7192@yahoo.com.cn　　陈磊，等.

　　1山东省青岛市市立医院普外科(山东青岛 266011)

　　2国家海洋局一所海洋生物活性物质重点实验室(山东青岛 266061)

　　3山东大学齐鲁医院普外科(山东济南 250012)

　　【关键词】结直肠肿瘤?肝?肿瘤转移

　　近20年来，虽然大肠癌(colorectal cancer,CRC)的治疗方法不断改进，但病人的预后并无明显改善，总体5年生存率不足50%，大约40%的病人在5年内出现腹腔复发和肝转移，但这些病人在手术前后的常规检查中(包括手术探查、CT、普通病理切片等)并未发现显性转移灶，这表明微小的转移灶客观存在着。随着分子生物学技术的发展，尤其是逆转录聚合酶链反应(reverse transcriptionpolymerase chain reaction,RTPCR)及荧光定量PCR技术的成熟和完善，检测微转移癌细胞已成为可能。本文就国内外CRC肝微转移的发生及检测方法作一综述。

　　1 微转移的概念

　　微转移是指用常规临床病理学方法不能检出的非血液系统恶性肿瘤的转移[1]，微转移灶常常是指小于2mm的癌细胞沉积[2]。一般来说，微转移灶无任何临床表现，常规手术探查、B超、CT、普通病理切片等很难发现。在血液中，常规方法不能检测出癌细胞，但血循环中已有癌细胞存在即属微转移，多数研究认为门静脉血中检测到癌细胞是肝微转移的早期事件，监测门静脉血癌细胞可预测肝微转移的存在或肝微转移的潜能。

　　2 大肠癌肝微转移的发生机制

　　CRC肝转移的发生主要是门静脉、肝动脉和淋巴液的回流所致，少数是腹腔内播散所导致。癌细胞经血流转移至内脏必须经过以下几个步骤：在原始部位浸润性生长→微血管形成→癌细胞侵犯微血管→癌细胞脱落→在血循环中生长→粘附在靶器官的血管上→在靶器官中生长[3]。具体过程如下[4]：(1)侵袭细胞外基质：原发灶中癌细胞分泌的各种酶类消化细胞外基质，导致癌细胞突破结缔组织构成的屏障。(2)进入门静脉系统：癌细胞与基底膜及血管内皮细胞粘附，在基质金属酶、肝素酶、胞浆素、弹力蛋白酶、尿激酶等作用下，癌细胞穿过血管内皮及基底膜，进入门静脉系统。(3)癌细胞在循环中存活：进入血液的癌细胞很少有进一步增殖的能力，大部分被宿主杀死，部分处于休眠状态，只有一小部分具有高转移潜能的细胞亚群能与血管内皮粘附，穿出管壁，形成转移灶。(4)癌细胞在肝脏内增殖：癌细胞在穿出血管后能否在一个新的微环境下生长，这是决定转移灶形成的关键。研究发现CRC较之腹腔其他消化器官的癌肿易发生肝转移，可能是与其癌细胞CEA及PGE2方面的生物学特性有关[5]。

　　3 大肠癌肝微转移的检测方法

　　3.1 连续切片法连续切片是最早用于肿瘤淋巴结微转移检测的方法，但此方法工作量大且易于遗漏，对CRC肝微转移的监测意义不大。

　　3.2 免疫组织化学及细胞化学技术癌细胞往往表达与其起源组织及其分化过程相关的蛋白，也可表现为正常基因表达产物的丢失，这些标志物的单抗成为肿瘤免疫组化诊断的有用探针。免疫组化及细胞化学检测方法简单实用，应用广泛，但所用抗体的敏感性和特异性尚有待提高。沈岩等[6]用APAAP免疫组化法结合广谱抗人细胞角蛋白单克隆抗体(mAB)KL1，成功检测到了裸鼠体内人结肠癌肝转移细胞。丁彦青等[7]用抗细胞角蛋白(CK)和癌胚抗原(CEA)单克隆抗体，对68例结肠癌根治术后经病理常规检查为转移阴性的584枚淋巴结进行免疫组化(ABC法)检测，结果13例29枚淋巴结中发现微小转移的癌细胞。

　　3.3 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)目前应用较多的有以下4种方法：①逆转录聚合酶链反应(Reverse transcriptasepolymerase chain reaction,RTPCR)法，扩增并检测肿瘤特异性RNA，即可发现存在于1×106个正常细胞中的1个癌细胞。Castells[8]运用该法检测外周血中CEAmRNA,发现CEAmRNA的阳性表达与远处肝转移具有明显的相关性。95例结直肠癌病人中有39例在循环血中检测到CEAmRNA。但目前RTPCR检测CRC肝微转移尚缺乏特异性和高表达的标志物。②突变等位基因特异性扩增(mutant allele specificamplification,MASA)法，通过检测肿瘤细胞中的基因突变、染色体重排而产生的稳定的异常DNA，从而检测到癌细胞的存在。MASA法可以检测出数万个细胞中某1个发生了基因突变的癌细胞。Hayashi等[9]采用MASA法检测CRC病人的外周血和门静脉血中Kras基因和p53基因突变的情况。在27例病人癌组织中，18例出现基因突变，11例常规手术的病人中有8例门静脉血中检出了突变基因，阳性率为73%。此法直接针对肿瘤细胞特有的突变位点进行检测，具有高特异性的优点，但由于许多肿瘤基因突变位点尚不明确，突变率低，故应受到一定限制。③强化单链构象多态性(enriched single stand conformation polymorphism,ESSCP)法，通过检测未知基因突变，从而增加微量癌细胞的阳性检出率，其敏感性可达1×106。④单管荧光定量PCR检测(fluorogenic quantiative PCR,FQPCR)法，该法的反应体系中除了普通PCR所需的引物外，还有一条荧光探针。其融合了PCR技术与DNA探针杂交技术的优点，解决了传统PCR技术不能定量和扩增产物易于污染的问题。FQPCR操作简单、快捷，结果准确，很方便于临床应用。

　　3.4 流式细胞术(flow cytometry,FC)采用针对癌细胞标志物的单克隆抗体结合荧光物质，如异硫氰酸荧光素(FITC)，使癌细胞染色，然后用流式细胞仪进行分析，着色细胞即被视为阳性。此方法的优势在于可在免疫放大检测的同时进行癌细胞的形态定量测定。Tollenaar等[10]用流式细胞仪分析DNA整倍体的多样性与结肠癌不同发展阶段的关系，20例结肠腺瘤，38例原位结肠癌，30例有淋巴结转移结肠癌，70例有肝转移结肠癌，DNA非整倍体出现率分别为腺瘤30%，原位结肠癌82%，淋巴结转移者57%，肝转移者92%，有其它部位转移者为100%。因此认为，DNA非整倍体的出现率可作为预测远处转移的指标。

　　4 大肠癌肝微转移标志物的选择

　　4.1 癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)CEA是相对分子量为180×103的糖蛋白，在胚胎期表达，成人后不表达，伴随肿瘤发生可重新表达的抗原，它存在于胚胎的胃肠粘膜上皮和一些恶性组织的表面。刘永昌等[11]以CEA为标记物，应用nested RTPCR对CRC病人门静脉血进行了检测，发现CEA阳性表达在临床早期已经出现，随分期进展而逐步增高，并随癌细胞恶性程度升高而上升。李世拥等[12]用同样的方法检测CRC病人的胆汁中CEA mRNA的表达情况，发现CEA mRNA阳性检出率与肝脏转移存在显著相关性，胆囊胆汁中的CEA mRNA扩增阳性者，术后发生转移率为33%。

　　4.2 粘附分子蛋白CD44粘附分子蛋白CD44基因位于11号染色体上，包含20个外显子，完整基因组扩增片段长度约为50kb。CD44分标准构型CD44s(Standardform)和异构CD44v(Variantisoform)，一般所说的CD44是指CD44v。在CRC细胞中，CD44v为无序的过度表达，多认为CD44v6、CD44v7与CRC转移和复发有关。Wong L等[13]用RTPCR技术，以CD44v的特异序列为靶基因，转录翻译CD44v蛋白，检测CRC病人，其灵敏度为106个外周血淋巴细胞中可检出10个肿瘤细胞，CD44v阳性检出率为16.67%，而无肿瘤病人的外周血单核细胞只有CD44s表达，没有CD44v表达。

　　4.3 细胞角蛋白(cytokeratin,CK)CK是细胞骨架系统中间丝的组成成分之一，至少含有30种不同的蛋白链，大致包括20种上皮细胞角蛋白和10种头发角蛋白，CK19(40kb)和CK8共同表达标记单层上皮，CK20(46kb)表达标记肠上皮[14]。骆玉成等[15]以CK20非同位素RTPCR方法检测CRC病人术前和术后外周血，54例病人中，外周血CK20阳性表达32例，阳性率为60%，其中有10例肝转移病人，8例出现CK20阳性表达，阳性率为80%。由此，可认为CK是检测CRC微转移的有效标记物，其中CK20mRNA是检测CRC肝微转移的敏感而特异的指标。

　　4.4 基质金属蛋白酶类(matrix metalloproteinase MMPs)MMPs是一种Zn2+依赖性的蛋白水解酶，能够降解多种基底膜和细胞外基质成分，在肿瘤的浸润和转移过程中起重要作用。MMP7是MMPs家族的重要成员，分子量28kD，是MMPs中唯一的由上皮性癌细胞特异性表达的酶;MMPs的其它成员则主要由肿瘤的间质细胞表达[16]。Mcdonnell研究发现MMP7由CRC细胞及个别异型性上皮细胞表达，而肿瘤间质和淋巴细胞中均不表达[17]，说是MMP7在CRC中的表达具有很强的癌细胞特异性。万远廉等[18]用RTPCR检测38例CRC，97.4%的CRC中MMP7mRNA表达阳性，而正常粘膜几乎不表达。朱民等同法检测阳性率为92.9%(26/28),正常组织则为7.1%(2/28)[19]。

　　4.5 相关突变基因肿瘤的发生与原癌基因的突变有关，因此检测突变基因可以发现肿瘤微转移。CRC发生及转移的相关基因有p53、DCC、APC、Ras、Bcl2、Myc、Jun、Fos、Fas等。这些基因中p53、DCC、APC在正常体内起抑癌作用，突变后变为癌基因;Ras、Bcl2、Myc、Jun、Fos、Fas与细胞(包括癌细胞)的凋亡有关，突变后细胞周期延长。在内外环境因素作用下，这些基因的突变造成肿瘤的发生、转移和复发。

　　4.6 增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA) PCNA可作为一种肿瘤的标记物，反映癌细胞的代谢和DNA、RNA的合成状态，其增殖活性与癌细胞的分化、浸润、转移、复发和预后有关。PCNA可以应用免疫组织化学法检测。刘永源等[20]发现CRC病人随着癌组织浸润程度越深，PCNA阳性表达率越高;有淋巴结转移病例PCNA阳性率高于无转移病例(P0.05)，检测PCNA的表达可作为判断结肠癌预后的指标。

　　4.7 血管生成相关标记物肿瘤新生血管是受血管生成促进因子和血管生成抑制因子共同调控，现今在诸多因素中的研究热点是血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)。VEGF是通过其与血管内皮细胞的两种特异性受体KIDCR(kinase insert domain containing receptor)和FLTK1(fmslike tyrosin kinsel)结合，直接刺激血管内皮细胞的增殖，从而增加微血管密度(microvascular denstin,MVD)。Kang等[21]报道联合检测原发癌灶的p53和VEGF的表达，可应用于预测CRC肝转移。近年来的研究已证实CRC微血管密度和肝转移呈显著的正相关，MVD不仅可视为独立的一项预后指标，也可作为肿瘤转移的预测指标。

　　5 CRC肝微转移的检测途径

　　目前研究较多的是通过周围静脉血、门静脉血及胆汁途径来检测CRC的肝脏微转移。

　　5.1 周围静脉血外周血中癌细胞的检测有利于发现早期的微转移。Funaki等[22]用CK20mRNA nested RTPCR法检测28例CRC病人的外周血，分析CK20mRNA阳性表达与病人预后的关系。结果8例复发病人其外周血CK20mRNA均为阳性，有肝转移的4例Dukes C期病人CK20mRNA也为阳性，1例Dukes A期或B期的病人CK20mRNA阳性，其临床分期应为Dukes C期。外周血易于采集，且病人无痛苦，是理想的检测途径，但检测物的选择尚需进一步研究。

　　5.2 门静脉血通过门静脉血检测CRC肝脏微转移有相对特异性。骆玉成等[23]的研究发生，75.9%的CRC病人门静脉血中具有癌细胞的微转移，即使是Dukes A期的微转移率已高达28.6%。这表明早期CRC也可能存在癌细胞血行播散。梁小波[24]研究表明，CRC早期在门静脉已有微转移出现，因为门静脉是大肠血回流必经之道，此处采血比周围血或骨髓可靠性更强，所以阳性率更高些。

　　5.3 胆汁1989年Yeatman[25]首次报道，在B超引导下穿刺胆囊取胆汁测定CEA值以诊断CRC肝转移。发现肝转移者其胆汁CEA值显著增高，其敏感度明显高于血清CEA检测;而且肝转移灶大小与胆囊汁CEA值呈正相关，但血清与胆汁CEA值之间并不相关。Yeatman推断其胆汁CEA可能由肝转移病灶直接分泌至胆汁中或可能通过Kuffer细胞摄取或直接进入肝细胞被微粒体分解移行胆汁中。除经胆囊穿刺获取胆汁外，也可通过十二指肠镜经壶腹置管获得。

　　6 小结

　　微转移概念的提出，是对目前临床分期的极大冲击。研究表明，即使目前临床所谓的“肿瘤早期”，其骨髓、血液、淋巴结、体液已经有肿瘤细胞的存在。结肠癌肝转移的发生取决于癌细胞的异质性、侵袭力以及机体的免疫状态，同时与宿主器官的微环境有关。转移性CRC中CEA、CK20、CA199、CD44V6、nm23、Cerb2、p53、Kras、VEGF、PCNA等的表达均较非转移性CRC明显增强，是目前较好的转移标志物。利用先进的检测手段如免疫组化、逆转录聚合酶链反应、荧光定量PCR和流式细胞仪分析等技术可提高CRC肝脏微转移的检出率。检测病人外周血、门静脉血及门静脉回流血中有无肿瘤细胞，可对CRC肝转移作出早期判断，从而在未形成明确的转移灶之前即给予全身化疗及免疫治疗，对CRC病人的预后具有重要意义。为进一步提高肝内微转移癌灶的检出率，应继续寻找肿瘤特异性的转移标志物，探讨检测肿瘤微转移的新技术。

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