自体静脉移植再狭窄与MMP1、MMP2及TIMP2的表达

　　作者：郝建　孙勇

　　【摘要】目的：通过测定自体静脉移植术后移植静脉管腔狭窄度、金属基质蛋白酶1(MMP1)、MMP2，金属蛋白酶特异性抑制剂2(TIMP2)的表达，探讨自体静脉移植术后再狭窄与金属蛋白酶家族(MMPs)及其特异性抑制剂(TIMPs)的关系。方法：60只Wister大鼠均行颈静脉腹主动脉移植术，在术后28d后取出移植静脉行病理学检查测量移植静脉管腔狭窄度，根据移植静脉管腔狭窄程度，分成正常、轻、中、重4组，并采用免疫组织化学方法(ABC法)行MMP1，MMP2及TIMP2的检测。结果：静脉移植后，移植静脉出现不同程度的狭窄。在狭窄的移植静脉，MMP1、MMP2和TIMP2高水平表达;静脉狭窄程度越重，MMP1、MMP2和TIMP2表达强度越高，MMP1、MMP2的升高幅度高于TIMP2的升高幅度。结论：自体静脉移植术后移植血管再狭窄的发生和发展与MMPs及TIMPs的表达失衡密切相关。

　　【关键词】静脉?移植，自体?缩窄，病理性?基质金属蛋白酶?金属蛋白酶?组织抑制剂

　　The expressions of MMP1,MMP2 and TIMP2 in auto transplanted venous restricture

　　HAO Jian,SUN Yong

　　Department of Surgery,Zouping County People’s Hospital (Shandong 256200,China)

　　【ABSTRACT】Objective:To determine the degree of venous restenosis and the levels of metalloproteinase1(MMP1),MMP2 and tissue inhibitor of metalloproteinase2(TIMP2) in order to study the role of metalloproteinases(MMPs) and tissue inhibitor of metalloproteinases (TIMPs) in the formation of the vascular restricture after the venous transplantation.Methods:Sixty Wistar rats were performed auto transplanting external jugular vein into abdominal aortic artery.The transplanted external jugular veins at 28th day postoperation were removed and the normal external jugular veins were also removed to determine the degree of restenosis by pathology,which were divided into smooth,mild,modest and severe groups according to the degree of the venous restenosis.The expressions of MMP1,MMP2 and TIMP2 in the veins in different groups were determined by immunohistochemistry . Results:The transplanted veins became stenotic postoperation and the expressions of MMP1,MMP2 and TIMP2 in the transplanted external jugular veins were stronger than the expressions in the normal external jugular veins,and the degree of promotion of expression of MMP1 and MMP2 was obvious than that of TIMP2 .The more stenotic the grafted veins was,the stronger the expressions were.Conclusion:The imbalance of the expression between MMPs and TIMPs play an important role in the formation of venous restricture after autovenous transplantation.

　　【KEY WORDS】Veins?Transplantation,anwlogous?Constriction,pathologic?Matrix matalloproteinases?Tissu inhibitor of mefalloproteinases

　　治疗动脉硬化的自体静脉血管转流手术，由于术后移植静脉再狭窄，严重影响了自体静脉移植的远期效果。基质金属蛋白酶(MMP)可以降解细胞生长和转移的屏障细胞外间质，为细胞移行提供空间。我们测定自体静脉移植血管再狭窄与基质金属蛋白酶的关系，试图从病因学角度探讨移植静脉的形成。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物

　　Wister 大鼠60只雌雄各半，体重250~350g，4个月龄，10%水合氯醛腹腔注射麻醉(2ml/kg),行自体颈外静脉腹主动脉移植术。另取10只正常Wister 大鼠颈静脉作为对照。

　　1.2 内膜厚度

　　实验后28d，取移植颈外静脉和正常颈外静脉，4%甲醛固定，梯度酒精脱水，透明，石蜡3μm切片，HE染色和VerhoeffVan Gieson染色，用计算机图像分析仪观察血管中段内膜厚度。

　　1.3 颈外静脉MMP1、MMP2 、 TIMP2表达

　　免疫组织化学方法(ABC法)。3%H2O2封闭液内源性过氧化酶后，微波抗原修复，2%正常羊血清封闭30min，分别加入MMP1、MMP2 及 TIMP2 (金属蛋白酶抑制剂2)特异性一抗(Santa Cruz公司，1：100稀释);相应的二抗(IgG/Biotin);辣根过氧化酶标记的链霉卵白素工作液;DAB显色，苏木素复染。TBS代替一抗作阴性对照。

　　1.4 结果判定

　　MMP1、MMP2及TIMP2均为细胞膜和细胞浆出现棕黄色颗粒为阳性细胞，应用多功能彩色图像分析系统对MMP1、MMP2 、TIMP2的蛋白表达进行图像分析，测定细胞的平均吸光度(A)，取其平均值为该标本的测量结果。

　　1.5 统计学分析

　　应用SPSS统计软件处理数据，组间表达程度比较采用方差分析和x2检验。

　　2 结果

　　2.1 术后颈外静脉内膜厚度变化

　　按照术后静脉狭窄度(用移植前后血管管腔面积比表示)分成正常、轻、中、重4组。正常为管腔闭塞10%，本组13例;10%~25%为轻度，21例;25%~40%为中度，16例;40%为重度，10例。血管管腔厚度变化见表1。

　　2.2 颈外静脉MMP1、MMP2 及 TIMP2 表达

　　术后颈外静脉MMP1、MMP2 及 TIMP2 的表达较正常颈外静脉表达明显升高，阳性表达水平与静脉狭窄程度正常、轻、中和重一致，即术后自体移植静脉管腔狭窄越明显，MMP1、MMP2 及 TIMP2 的表达阳性静脉数目和水平越高。MMP1和MMP2 的升高幅度较TIMP2的升高幅度明显。结果见表1。表1 自体静脉移植手术前后血管管腔内膜厚度变化和MMP1、MMP2 及 TIPM2 的水平(略)

　　3 讨论

　　自体移植静脉再狭窄的发生机理十分复杂，迄今尚未完全明了，但内膜增生和内膜下血管平滑肌细胞(VSMC)增殖移行现象已得到证实，VSMC的转化、增殖和迁移在再狭窄的发生过程中起到非常重要的作用[1、2]。细胞外基质和细胞基底膜是细胞生长和扩散的基础屏障，细胞突破基底膜，离开原来部位能够迁移都需要MMPs分解细胞外基质和细胞基底膜。

　　基质金属蛋白酶(MMPs)是一组锌离子依赖性蛋白酶家族，根据作用底物特异性的不同，可将其分为4类，即胶原酶、(collagenase)、明胶酶(gelatinases)、基质溶解酶(stromelysins)、膜型基质金属蛋白酶(membranetype matrix metalloproteinases MTMMPS)。金属蛋白酶MMP2是明胶酶，它的作用底物为Ⅵ、Ⅶ、Ⅺ型明胶、纤维粘连蛋白、层粘连蛋白、蛋白聚糖、弹性蛋白等。MMP1是胶原酶类，主要降解Ⅰ及Ⅲ型胶原，也是启动胶原降解的唯一的酶，在胶原降解小片后，MMP2发挥作用降解明胶[4、5]。这些胶原和蛋白质是构成细胞外基质的主要成分。基质金属蛋白酶抑制剂(TIMPs)是一个多基因家族的编码的蛋白，有4个成员，研究比较多的是TIMP1、TIMP2 二者都可与MMPs呈1：1结合，但 TIMP2对MMPs的抑制作用较TIMP1强7~10倍以上。不同的TIMPs的基本功能皆是特异抑制MMPs活性。作用途径一是阻止MMPs酶原活化，二是抑制已活化的MMPs的活性。 TIMP2可与非共价键与活化的MMP2形成复合物，有效地抑制MMP2的胶原分解活性及明胶活性，还可以抑制MMPs家族所有成员的水解活性，从而抑制细胞外基质和细胞基底膜被分解，限制细胞的局部生长和多动。

　　移植静脉管腔狭窄度是评价血管狭窄比较客观的指标，本实验术后28d移植静脉全部管腔通畅，但都出现内膜不同程度的狭窄，而且管腔狭窄越明显，MMP1、MMP2 及TIMP2的水平越高。从表中可以看到，虽然伴随移植静脉管腔狭窄加重，TIMP2 阳性表达率和表达水平也大幅度提高，但始终没有MMP1、MMP2 升高程度明显。在重度组，10例亦全部表达TIMP2，但其强度较MMP1、MMP2弱。MMP1，MMP2的升高幅度高于TIMP2的升高幅度，说明TIMPs的抑制作用小于MMPs分解细胞外基质和基底膜的作用，细胞外基质以及血管壁的基底膜被逐渐分解，血管内皮细胞及血管平滑肌细胞的离开其原来位置，向静脉管腔突出。病情不断反复，最终导致血管狭窄。MMP1、MMP2 及TIMP2的水平越高，细胞增殖和转移越多，血管管腔变得越狭窄。

　　MMP1、MMP2 及TIMP2的不平衡表达促进移植静脉再狭窄的形成，MMP1、MMP2 及TIMP2表达的测定可作为病情严重程度和预后发生、发展的指标。

　　参　考　文　献

　　[1]Faies PL,Marin ML,Veith FJ,et al.Immunolocalization and temporal distribution of cytokine during the development of vein graft intimal hyperplasia in an experimental model[J].J Vasc Surg,1996,24(3):463417.

　　[2]Komalavilas P,Shah PK,Jo H,et al.Activation of mitogenactived protein kinase pathway by cyclic GMP and cyclin GMPdependent protein kinase in contractive vascular smooth muscle cells[J].J Biol Chem,1999,274(48):3430334309.

　　[3]朱民，姜金波，寿楠海.大肠癌组织中MMP1、MMP2的基因表达[J].中国现代普通外科进展，2004，7(6)：358.

　　[4]林峰，王强.基质金属蛋白酶及其抑制剂与大肠癌肝转移的研究进展[J].肿瘤杂志，2002，8(3)：174176.

　　[5]Matri HP.Role of matrix metalloproteinases in the progression of mallesions[J].Press Med,2000,29(14):811817.

　　郝建,等.自体静脉移植再狭窄与MMP1MMP2及TIMP2的表达

　　山东省邹平县人民医院外科(山东邹平 256200)