黄芪多糖对脑出血大鼠脑组织含铁血红素氧合酶1蛋白表达及含水量、超微结构的影响

黄芪多糖对脑出血大鼠脑组织含铁血红素氧合酶1蛋白表达及含水量、超微结构的影响作者：刘兵荣，肖瑾，丁新生    作者单位：210029南京医科大学第一附属医院神经内科［刘兵荣（硕士，现在马鞍山市中心医院），丁新生］；马鞍山市中心医院神经内科（肖瑾）    【摘要】  目的 研究黄芪多糖对脑出血大鼠脑组织含铁血红素氧合酶1(HO1)蛋白表达及含水量、超微结构的影响。方法 139只雄性SD大鼠随机分为假手术组、脑出血组与黄芪多糖治疗组。采用Ⅶ型胶原酶诱导法制作SD大鼠脑出血模型，假手术组以等量生理盐水代替Ⅶ型胶原酶;黄芪多糖治疗组给予黄芪多糖25 mg/kg腹腔注射，每天1次，直至处死。分别于脑出血后12 h、24 h、2 d、4 d、7 d 5个时间点对各组大鼠进行神经行为学评分，测量脑组织含水量和用免疫组化法检测HO1蛋白表达，透射电镜观察脑出血后4 d 血肿周围神经元的超微结构。结果 脑出血组与黄芪多糖治疗组大鼠脑出血后脑组织 HO1 表达以及脑组织含水量较假手术组显著增高(均P<0. 01)；脑出血后12 h HO1蛋白即有表达, 2 d 达高峰, 尔后逐渐下降。 黄芪多糖治疗组与脑出血组比较， HO1表达的变化相同,但各时间点表达均高于脑出血组（P<0.05～0.01）；脑组织含水量各时间点均显著降低（P<0.05～0.01）；4 d、7 d时大鼠神经行为学评分明显减少(均P<0.01)，神经元超微结构病理改变轻。结论 黄芪多糖可促进脑出血后脑组织HO1的表达, 这可能是其减轻脑出血后脑水肿和脑组织损伤的机制之一。    【关键词】  脑出血；血红素氧合酶1；脑水肿；黄芪多糖    Effects of Astragalus polysaccharide on expression of heme oxygenase1 protein, moisture and the supermicrostructure of brain tissue in rats with intracerebral hemorrhage  LIU Bingrong, XIAOJin, DING Xinsheng.Department of Neurology,the First Affilliated Hospital of Nangjing Medical University, Nanjing 210029,China    Abstract：Objective  To study the effects of Astragalus polysaccharide on the expression of heme oxygenase1 (HO1) protein, moisture and the supermicrostructure of brain tissue in rats with intracerebral hemorrhagic ( ICH ). Methods  139 SpragueDawley male rats were randomly divided into shamoperation group,ICH group and Astragalus polysaccharide treatment group. ICH models were made by injection of collagenaseⅦ. Shamoperation group was instead by saline.Treatment group was administrated Astragalus polysaccharide 25 mg/kg by peritoneal injection once a day. The brain tissue specimen in every group was gathered at 12 h, 24 h ,48 h ,4 d and 7 d respectively after operation and the score of neurological behavior in rats were observed.The expression of HO1 in rat brain after ICH was detected with immunohistochemistry method, the moisture in brain tissue was measured at the same time.Ultrastructures of the cells around the hematoma were observed with transmission electron microscope.Results  Compared with shamoperation group, the expression of HO1 and moisture in brain tissue in ICH group and treatment group were obviously increased ( all P< 0. 01). HO1 protein expressed at 12 h, peaked at 2 d, and then lowered gradually after ICH. Contrast to ICH group, the expression of HO1 protein in treatment group showed similar trend. But the expression of HO1 protein at different time points was significantly higher in treatment group（P<0.05～0.01）; moisture of brain tissue in treatment group was obviously decreased（P<0.05～0.01）; the scores of neurological behavior were decreased significantly at 4 d,7 d ( all P< 0.01).The pathological changes of ultrastructures of the cells around the hematoma were slighter. Conclusions  Astragalus polysaccharide can enhance the expression of HO1 protein, which may be related with its antiedema effect following ICH.    Key words：intracerebral hemorrhage; heme oxygenase1; brain edema; Astragalus polysaccharide    脑出血(ICH)的病死率和致残率与脑水肿的发生和发展有密切的关系。红细胞作为血肿的主要成分对迟发性脑水肿的形成起决定作用［1］。ICH后红细胞释出的血红蛋白(Hb), 特别是其中的含铁血红素是导致神经元损伤的重要原因。含铁血红素氧合酶1 ( HO1) 是含铁血红素的代谢限速酶, 在脑内的许多急、慢性应激条件下, 特别是在脑实质的出血性或缺血性损伤时, 其表达水平都会显著增高, 并在减轻神经元的损伤中起到重要的作用。本研究采用实验性大鼠ICH模型，观察黄芪多糖对大鼠ICH后血肿周围脑组织HO1表达水平、含水量及超微结构的影响，以探讨黄芪多糖对ICH后脑组织的保护作用及其机制。1  材料与方法    1.1  材料    1.1.1  动物及分组  健康雄性SD大鼠139只,质量250～300 g，鼠龄8～10周，南京医科大学动物实验中心提供。随机分为假手术组（33只）、ICH组（53只）、黄芪多糖治疗组（黄芪组，53只）。各组又分为造模后12 h、24 h、2 d、4 d、7 d共5个时间点，假手术组每个时间点6只（其中4 d 9只），后两组每个时间点10只（其中4 d 13只）。    1.1.2  仪器与药品及试剂  立体定位仪（美国Stoelting公司）；德国leica Q500图文处理系统；电子天平(上海天平仪器厂)；微量进样器（上海医用仪器厂）；Olympus显微照相仪、电子显微镜（JEM1010，日本）；黄芪多糖（美国泛华医药公司，Pharmagenesis提供，批号8k01101）；Ⅶ型胶原酶（美国Sigma公司）；兔抗大鼠HO1免疫组化试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。    1.2  方法    1.2.1  ICH模型制作与给药  参考Rosenberg等［2］的方法，大鼠用10%水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射麻醉后俯卧位固定于立体定位仪上，碘伏消毒局部皮肤，行顶部正中切口，调整立体定位仪使大鼠前囟和后囟在同一平面，以前囟中央为原点，于前囟后0.2 mm、中线向右旁开2.8 mm处钻一直径1 mm的小孔，用固定于立体定位仪上的微量进样器（5 μl）沿钻孔进针，深度为6 mm即苍白球［3］位置。ICH组和黄芪组大鼠被缓慢注射2 μl（含0.4 U）Ⅶ型胶原酶，假手术组大鼠注入2 μl灭菌生理盐水，4 min注射完毕，留针5 min后缓慢将针退出，缝合皮肤，回笼饲养。黄芪组大鼠造模后 4 h 即腹腔注射黄芪多糖25 mg/（kg·d），直至处死。ICH组和假手术组大鼠不予任何药物。    1.2.2  神经行为学评分  动物苏醒后立即进行神经行为学评分，依照Bederson标准［4］，0分：无任何症状；1分：提尾时对侧肢体屈曲内收；2 分：对抗侧方推力降低，并有1分症状；3 分：爬行时向对侧划圈，并有2分症状； 4分：意识丧失，不能行走。3分动物入选本实验，不够标准者抛弃，重新制模补充入组。各组动物处死前再评分1次。    1.2.3  脑组织含水量测定  在预定时间点将黄芪组和ICH组各5只、假手术组3只大鼠深度麻醉后断头取脑，左右大脑半球分开，用电子天平（分度值0.1 mg）称湿重，然后置105℃烤箱中，烘烤48 h 至恒重后再称重。按Elliott公式，脑组织含水量= (湿质量-干质量) /湿质量×100%。    1.2.4  血肿周围脑组织HO1阳性细胞数检测  于预定时间点，将各组5只（假手术组3只）大鼠用10%水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射麻醉后打开胸腔，剪开右心耳，左心室插管至主动脉，依次灌入生理盐水300 ml 和4℃ 4%多聚甲醛400 ml，固定后开颅取脑，以针孔为中心，取厚为2 mm 的冠状切片, 再行后固定、常规脱水、透明及浸蜡包埋，最后在切片机上连续切片，片厚4 μm，作HO1免疫组化染色。操作按照SABC试剂盒说明书进行,并以PBS代替一抗作阴性对照。染色后光学显微镜下观察细胞胞浆中有棕黄色颗粒为HO1阳性细胞。在400倍高倍镜下随机取血肿周围3个不重叠视野,计数HO1阳性细胞数。    1.2.5  脑组织电镜切片制作  制模后4 d每组各取3只大鼠麻醉后断头，迅速开颅取脑置冰玻璃片上，在血肿外上方脑皮质区取大小约1.0 mm×1.0 mm×1.0 mm组织3～4块，经5%戊二醛固定，1%鹅酸环氧树脂618原位包埋，超薄切片，双铅染色，置于电镜下观察、照相。    1.2.6  统计学方法  数据以均数±标准差(±s)表示，多组均数间的比较采用单因素方差分析，ICH组与黄芪组大鼠神经行为学评分采用成组t检验，阳性细胞计数比较采用Poisson 分布两均数的比较。2  结  果    2.1  各组神经行为学评分比较  见表1。假手术组大鼠无明显神经功能缺损，评分均为0分。黄芪组 ICH 后4 d、7 d 神经行为学评分明显低于ICH 组( 均P< 0.01)。    2.2  各组脑组织含水量比较  见表2。ICH 组各时间点及黄芪组 12 h ～4 d组脑组织含水量明显高于假手术组（ 均P<0.01）, ICH 后4 d达高峰;  黄芪组各时间点亚组脑组织含水量显著少于ICH组（ P<0.05～0.01），7 d时已恢复正常。    2.3  各组大鼠血肿周围脑组织HO1阳性细胞数的比较  见表3及图1。假手术组仅在针道附近见到少量HO1阳性细胞；黄芪组和ICH组ICH后12 h组血肿周围脑组织可见HO1阳性细胞，并逐渐增多,于2 d达峰值,4 d 和7 d 逐渐下降，各时间点均显著高于假手术组（均P< 0.01）；黄芪组ICH后24 h～7 d组HO1阳性细胞数明显多于ICH组（P<0.05～0.01）。表1  ICH组与黄芪组ICH后各时间点神经行为学评分比较 注：与ICH组比较*P<0.01表2  各组大鼠ICH后各时间点脑组织含水量的比较注：与假手术组比较*P<0.01；与ICH组比较△P<0.05，△△P<0.01表3  各组大鼠ICH后各时间点HO1阳性细胞数的比较注：与假手术组比较*P<0.01；与ICH组比较△P<0.05，△△P<0.01    2.4  各组脑组织超微结构变化  假手术组脑组织神经元膜完整，内质网、线粒体、高尔基体等超微结构基本正常，核大而圆，核仁明显。ICH组血肿周围神经元变性，胞浆呈空泡状，核膜凹陷，核内染色质凝聚，线粒体肿胀，嵴断裂，胞膜不完整。黄芪组血肿周围神经元轻度变性，胞浆呈少量空泡状，核膜轻度皱褶，核内染色质轻微聚集成块,线粒体轻度肿胀，少量内嵴断裂，胞膜不完整。见图2。    图1  A：ICH组大鼠血肿周围脑组织有OH1阳性细胞（胞浆中有棕黄色颗粒）；B:黄芪组大鼠血肿周围脑组织HO1阳性细胞明显多于ICH组（DAB ×400）  图2  A：ICH组血肿周围神经元变性，胞浆呈空泡状，核膜凹陷，核内染色质凝聚，线粒体肿胀;B：黄芪组血肿周围神经元轻度变性，胞浆呈少量空泡状，核膜轻度皱褶，核内染色质轻微聚集成块,线粒体轻度肿胀，少量内嵴断裂（醋酸铀染色 ×6000）3  讨  论    研究［5］表明ICH后的脑损伤存在多种机制：早期血肿机械占位效应、血脑屏障受损、自由基损伤、炎性损伤、氧化应激、凝血瀑布反应的激活、凝血酶的产生、Hb毒性作用等。近年有学者［6］发现, ICH后血肿红细胞降解产物Hb 能启动一系列脂质过氧化过程,破坏血脑屏障, 诱发脑水肿, 认为这可能是ICH后细胞损伤的重要机制之一。体外实验［7］发现，将神经元暴露于Hb中可造成神经元死亡，而进一步实验显示这种毒性作用呈剂量依赖性。另有研究［1,8］表明，Hb的代谢产物铁、胆绿素均有神经毒性，随着对Hb毒性作用认识的深入，人们越来越多的开始关注Hb代谢的限速酶——HO在ICH后的作用及其机制。HO主要有两个同工酶: HO2属结构型同工酶, 表达水平不受组织的功能状态影响; 而HO1则在各种急、慢性应激状态下可显著增高, 一方面对抗增强脂质过氧化反应, 以其水平增高来作为氧化应激的标志, 另一方面清除因血脑屏障开放、血管破裂和细胞损伤而漏出增多的含铁血红素蛋白, 特别是Hb［9］。    近年来有学者认为, HO1 的表达可通过抗氧化而起神经保护作用。Hb是产生自由基和脂质过氧化的催化剂, HO可加快其降解,并利用这些降解产物起到抗氧化作用,从而减轻甚至消除继发性损伤。Suzuki等［10］对大鼠蛛网膜下腔出血的研究发现,HO1催化血红素的代谢产物胆红素，具有很强的抗氧化作用,能拮抗脑缺血、缺氧、再灌注过程中产生的大量自由基;释放的铁能诱导铁蛋白生成,而铁蛋白中活性铁的隔离可使细胞从氧化损伤的超敏状态转为低敏状态,从而发挥对脑损伤的保护作用。本实验结果显示HO1表达水平从ICH后12 h 就开始增高, 2 d时达峰值,尔后逐渐下降；与文献［5］报道大致相似。同时本研究发现，血肿形成后脑组织水肿产生迅速，与假手术组比较，大鼠ICH后脑组织 HO1表达以及脑组织含水量显著增高(P<0.05～ 0. 01)， HO1 的表达在开始及高峰时间均早于脑水肿的变化，与吴家幂等［11，12］的报道基本一致。    黄芪的主要活性成分是黄芪多糖，药理研究发现其具有降低血液黏度、扩张血管、降低血脂、改善微循环等作用。本研究ICH后灌服黄芪多糖的大鼠, 神经行为学评分(4 d,7 d)明显低于ICH组(均P<0.01), 脑组织含水量显著少于ICH组（ P<0.05～0.01），HO1阳性细胞数明显多于ICH组（P<0.05～0.01）,HO1的表达水平明显上调。提示该药可使脑组织在出血早期对Hb 的清除能力明显增强, 从而切断含铁血红素介导的氧化应激级联反应, 减少神经元和血脑屏障损伤,减轻脑水肿。电镜观察发现ICH后黄芪组血肿周围神经元的超微结构改变较ICH组明显减轻，进一步显示黄芪对ICH后继发性损伤的保护作用。 这可能是与黄芪多糖清除自由基的作用有关，在一定范围内较高浓度的黄芪提取液对超氧阴离子自由基和脂质自由基具有清除作用, 且随着其浓度的增高对自由基的清除能力逐渐增强［13］。因此，黄芪多糖可以通过适度促进ICH后HO1表达的上调, 减轻代谢产物级联式释放所引起的脑损伤，从而减轻ICH后脑水肿，改善神经元结构的损伤。黄芪多糖还可能通过抑制核因子（NF）κB活化［14］等其他途径，来减轻ICH后脑组织的损伤。但是本研究工作是在实验水平探讨该药对HO1 表达的影响, 该药物的具体作用环节和作用方式尚需进一步研究明确。【参考文献】  ［1］Wu JM,Hua Y, Keep RF,et al.Iron and ironhandling proteins in the brain after intracerebral hemorrhage ［J］. 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