红景天甙对帕金森病小鼠模型PI3K/蛋白激酶B信号转导途径的影响

红景天甙对帕金森病小鼠模型PI3K/蛋白激酶B信号转导途径的影响作者：张宇红，叶民，汪锡金，王刚，杨红旗，马建芳，王志全，陈生弟    作者单位：200025上海交通大学医学院附属瑞金医院神经科、帕金森病诊疗与研究中心    【摘要】  目的 研究红景天甙对帕金森病（PD）小鼠脑组织中PI3K/蛋白激酶B（PKB）信号转导途径的影响，及其神经保护作用的机制。方法 30只C57BL雄性小鼠，分为正常对照组、PD组、红景天甙组，每组10只。用蛋白印迹法检测小鼠纹状体中Akt/pAkt（ser 473）及其下游糖原合成酶激酶3β（GSK3β）/磷酸化糖原合成酶激酶3β［pGSK3β（ser 9）］、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3（aspase3）、BAD和bcl2的表达。结果 红景天甙组纹状体pAkt（ser 473）表达（0.5487±0.01376）比PD组（0.3069±0.08734）显著增加（P<0.05）；pGSK3β（ser 9）（0.6959±0.3327）蛋白表达较PD组（0.4884±0.02257）显著增加（P<0.05）。红景天甙组的bcl2/BAD比值（1.2669±0.231）明显高于PD组的0.4583±0.088（P<0.05）。红景天甙组小鼠纹状体中活化的caspase3 蛋白（0.0874±0.0109）明显较PD组（0.1409±0.089）下降（P<0.05）。结论 红景天甙可能通过使PI3K/PKB信号转导途径中Akt磷酸化（ser 473）蛋白的表达增加，以及其下游的靶点GSK3β在ser 9位点的磷酸化程度增加；能够上调bcl2/BAD比值、抑制caspase3蛋白的活化，而起到抑制神经元的凋亡及神经保护作用。    【关键词】  红景天甙；帕金森病；PI3K；蛋白激酶B    Salidroside's effect on PI3K/PKB signaling in Parkinsonian mice models induced by MPTP  ZHANG YuHong, YE Min，WANG XiJinDepartment of Neurology, Clinical & Research Center for Parkinson Disease, Ruijin Hospital, The Medical School of Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200025, China    Abstract：Objective  To investigate the salidroside's effect on PI3K/PKB signaling in Parkinsonian mice models induced by 1methyl4phenyl1, 2, 3, 6tetrahydropyridine (MPTP).Methods  The C57BL mice were divided into 3 groups: MPTP group(10), MPTP+ salidroside group(10), saline control group(10). The protein expressions of Akt, pAkt(ser 473), GSK3β, pGSK3β(ser 9), bcl2, BAD,and caspase3 were detected by Westernblot.Results  The protein level of pAkt(ser 473) in striatum was significantly reduced in MPTP group（0.3069±0.08734）than that in MPTP+ salidroside（0.5487±0.01376）and saline control groups(0.5055±0.0524) (P<0.05, respectively); The expression of pGSK3β (ser 9) protein was obviously increased in MPTP + salidroside group (0.6959±0.0332) than that in MPTP group (0.4884±0.0225) (P<0.05); The bcl2/BAD ratios of MPTP + salidroside group (1.2669±0.231) were much more increased than that of MPTP group (0.4583±0.088, P<0.05); Expressions of Active caspase3 in MPTP + salidroside mice were much lower than in MPTP mice.Conclusion  The neuroprotective mechanism of salidroside may effect on phospholateion activation of Akt at ser 473 site and GSK3βat ser 9 site in PI3K/PKB ; Saliodroside can partially decrease the Bcl2/BAD ratio by modulating the bcl2 and BAD levels and inhibit the activation of caspase3 protein ,therefore it can prevent apoptosis from neurons.    Key words：Salidroside; Parkinson's disease; PI3K; protein kinase Ｂ       帕金森病（PD）的病理改变以中脑黑质致密部多巴胺（DA）能神经元大量变性、纹状体DA含量显著减少为特征。本课题组以往的研究［1］发现,红景天甙具有一定的抗黑质神经细胞凋亡的作用,本研究将观察红景天甙对PD小鼠 PI3K/PKB信号途径中Akt蛋白和其下游信号蛋白糖原合成酶激酶（GSK）3β，以及与神经元凋亡相关的信号蛋白天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3（aspase3）、Bcl2和BAD的影响，以探讨红景天甙神经保护的细胞信号传导机制。1  材料与方法    1.1  材料  雄性8周龄健康C57BL小鼠30只（购自上海BK动物实验有限公司），体质量19～23 g。随机分为PD模型组（PD组），红景天甙干预组（红景天甙组）及正常对照组，每组10只。主要试剂：兔抗蛋白激酶B(Anti Akt) 多克隆抗体、磷酸化的兔抗蛋白激酶B［Anti pAkt（ser 473）位点］多克隆抗体、兔抗GSK3β多克隆抗体以及磷酸化的兔抗GSK3β［Anti pGSK3β(ser 9)］多克隆抗体（均购自美国CELLSIGNAL公司）；单克隆抗体Bcl2、BAD 以及caspase3（购自美国Santa Cruz公司）；BetaActin（美国Sigma公司）；1甲基4苯基1, 2, 3, 6四氢吡啶（MPTP） (美国Sigma公司)；红景天甙（上海绿谷药业提供）。    1.2  方法    1.2.1  PD模型制作及处理  正常组小鼠腹腔注射生理盐水0.3 ml 每天1次连续14 d,PD组小鼠腹腔注射 MPTP（30 mg/kg），每天1次连续7 d，再腹腔注射生理盐水0.3 ml，每天1次，连续 7 d；红景天甙组：MPTP（30 mg/kg）腹腔注射7 d，红景天甙（50 mg/kg）腹腔注射，每天1次，连续14 d。    1.2.2  免疫印迹检测  完成药物注射次日将小鼠用5％戊巴比妥钠（100 mg/kg）腹腔注射麻醉后，快速断头取脑，取纹状体组织，-70℃冰箱保存。取纹状体组织用PBS洗1次，加入组织蛋白裂解缓冲液500 μl。匀浆离心后，取上清。用二辛可宁酸法测定蛋白含量。取30 μg样本经十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳( SDSPAGE)凝胶上分离蛋白后, 转印蛋白至PVDF膜，5％脱脂奶粉封闭，分别加Akt多克隆抗体（按1：200稀释）、pAkt(ser 473)多克隆抗体（1：100稀释）、GSK3β多克隆抗体（1：400稀释）、pGSK3β(ser 9)多克隆抗体（1：100稀释）、Bcl2单克隆抗体(1:300)、BAD单克隆抗体(1:300)、caspase3单克隆抗体(1:250)。TBST（20 mmol/L TrisHCl pH 7.4，140 mmol/L 氯化钠，0.1% Tween20）缓冲液洗5 min×3次。辣根过氧化物酶标记抗兔二抗室温下孵育1 h。洗后，化学发光法显影。    1.2.3  统计学方法  检测结果用均数±标准差(±s)表示,数据的处理用SPSS 10.0软件包完成四组数据比较采取单因素方差分析。2  结  果    2.1  各组小鼠纹状体中Akt及pAkt（ser 473）的表达  3组小鼠脑纹状体中总的Akt表达的差异无统计学意义（P>0.05）。PD组纹状体中pAkt（ser 473）表达明显低于正常对照组（P<0.01）；红景天甙组pAkt(ser 473)表达比PD组显著增高（P<0.01）。见表1。    2.2  各组小鼠纹状体中GSK3β及pGSK3β(ser 9)的表达  3组小鼠脑纹状体中GSK3β表达差异无统计学意义（P>0.05）。PD组纹状体中pGSK3β(ser 9)的磷酸化比正常对照组明显降低（P<0.01）；红景天甙组GSK3β(ser 9)的表达较PD组有显著增加（P<0.01）。见表1。    2.3  各组小鼠纹状体中Bcl2及BAD的表达  PD组的bcl2/BAD比值（0.458±0.088）显著低于红景天甙组（1.2669±0.231）（P<0.05）和正常对照组（2.947±0.443）（P< 0.01）。见表1和图3。    2.4  各组小鼠纹状体蛋白中caspase3前体蛋白和活化caspase3蛋白表达  PD组caspase3前体蛋白及活化caspase3蛋白表达明显多于红景天甙组（均P<0.05）和正常对照组（P< 0.05，P< 0.01）。见表1。表1  各组小鼠脑纹状体所测定蛋白表达比较 注：与PD组比较*P<0.01，△P<0.053  讨  论    在神经元的发育、生存和功能的许多方面，PI3K/PKB是一条作用十分重要的信号传导途径［2～5］。而Akt 又是位于此途径上游最重要的调节蛋白之一。Akt的功能涉及细胞营养代谢、细胞存活与生长、细胞凋亡、细胞周期调控等诸多方面。Akt 在3 磷酸肌醇及3 磷脂肌醇依赖激酶作用下被激活。磷酸化是Akt 激活的主要机制，激活Akt可以保护细胞存活，减轻损伤。是脑损伤治疗的重要靶分子，具有药物开发与应用价值［6～8］。GSK3是一个多功能的丝氨酸／苏氨酸类激酶，在真核生物中普遍存在。在动物中参与诸如糖原合成,多种蛋白的转录激活和发育调控,细胞的增殖,分化和凋亡等许多生命活动的信号转导,具有广泛的细胞调节功能［9］。越来越多的证据表明GSK3β是凋亡的主要调节因子。营养因子减少导致的神经元凋亡也提示是由GSK3β活化介导。Akt是GSK3β的上游激酶，其激活可以引起GSK3β的抑制。Akt可以在Ser 9位点上使GSK3β磷酸化，因此使GSK3β失活。在我们的前期实验［1］中发现，给予红景天甙干预治疗后，PD模型小鼠纹状体蛋白的胶质源性神经营养因子（GDNF）分泌增加，黑质的多巴胺能神经元在一定程度上得到了保护。本实验PD组小鼠Akt在Ser 473位点上的磷酸化水平明显低于正常对照组；红景天甙组pAkt(ser 473)表达显著增加（P<0.01），说明Akt蛋白有了磷酸化激活，这对神经元的存活非常有利。同时，也发现在Akt通路的下游信号蛋白中，红景天甙组pGSK3β(ser 9)表达显著增加，使GSK3β磷酸化，抑制了GSK3β的活化，这可能起抗凋亡的作用，使神经元损伤程度减轻。    GSK3β的激活也介导了由于营养因子减少引起的神经元凋亡［10］。 GSK3β也可能是几种凋亡途径的关键介导因子，可以引起caspase3的激活，促进一系列的凋亡过程［11］。本研究结果显示红景天甙的干预减弱了caspase3 的活化程度。此外，Bcl2是一个抗凋亡蛋白，在调节多种形式的凋亡过程中起重要作用，BAD抑制bcl2的作用，bcl2/BAD比值是一种细胞存活的标记［12,13］。本实验发现，红景天甙在一定程度上提高了bcl2 表达和降低 BAD表达的水平 ，使bcl2/BAD比值的降低程度减小。提示红景天甙不仅启动细胞的生存信号，而且激活抗凋亡信号蛋白，抑制凋亡信号蛋白表达。 因此，PI3K/PBK是红景天甙神经保护作用的一条重要信号途径，而Akt、GSK3β、caspase3、BAD和bcl2可能是该途径的起主要作用的靶点。【参考文献】  ［1］张宇红，陈生弟，李江林,等.红景天甙促进帕金森病模型小鼠表达内源性GDNF保护多巴胺能神经元［J］.中华神经科杂志，2006, 39:540.  ［2］Cheng CM, Reinhardt RR, Lee WH, et al. 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