沙漠干热环境下猪腹部肠管火器伤后肝组织核因子κB的表达

　　作者：刘江伟，张永久，李泽信，吕月涛，许永华，李建英，卢开柏 作者单位：1.兰州军区乌鲁木齐总医院普外科，新疆 乌鲁木齐830000;2. 兰州军区乌鲁木齐总医院动物实验中心，新疆 乌鲁木齐830000

　　【摘要】 目的探讨沙漠干热环境下猪腹部肠管火器伤后肝脏组织核因子κB(NFκB)的表达和肝功能的变化。方法沙漠干热环境组和常温环境组健康长白仔猪各42头随机等分为对照组和伤后1、2、4、8、12小时和24小时组，实验组建立腹部火器伤肠管穿透模型后，用免疫组化图像分析法测定各组肝脏组织内NFκB的表达，同时测定血清中谷丙转氨酶(ALT)水平。结果伤后各组肝组织NFκB表达明显高于对照组，沙漠干热环境组于伤后1小时和4小时出现2个高峰;常温环境组于伤后1小时和8小时出现2个高峰。血清ALT水平于伤后显著增高，并于伤后2小时出现第1个高峰，沙漠干热环境组和常温环境组分别于伤后8小时和12小时出现第2个高峰。结论沙漠干热环境下腹部肠管火器伤后肝脏NFκB的表达增加并伴随肝功能损伤，而且峰值较常温组提前出现，提示腹部肠管火器伤后靶向NFκB的干预治疗在沙漠干热环境下应及早进行。

　　【关键词】 腹部损伤;肝损伤;火器伤;沙漠环境;核因子κB

　　基金项目：兰州军区医药卫生科研基金(LXH2005019)

　　Expressions of NFκB in hepatic tissues following intestinal perforation due to abdominal firearm wound in dryheat environment of desert in pigs

　　LIU Jiangwei,ZHANG Yongjiu,LI Zexin,et al.

　　Department of General Surgery,Urumuqi General Hospital of Lanzhou Military Region of PLA,Urumuqi830000,China

　　Abstract：ObjectiveTo investigate the expression of NFκB in hepatic tissues and changes of hepatic function following intestinal perforations due to abdominal firearm wound in dryheat environment of desert in pigs.MethodsA total of 84 Chang-Bai piglets were randomly divided into 7 groups in normal temperature environment group and dryheat desert environment group respectively: control group and postwounded 1h group,2h group,4h group,8h group,12h group,24h group.The model of intestinal perforations due to abdominal firearm wound was established in wounded groups.Expressions of NFκB were measured with immunohistochemistry and image analysis in all groups.Serum ALT levels were also determined at the same time.ResultsExpressions of hepatic NFκB in wounded groups were significantly elevated compared with control group,there were two peaks in 1h group and 4h group in dryheat desert environment group,and two peaks in 1h group and 8h group in normal temperature environment group.Levels of serum ALT in wounded groups were significantly elevated as compared with control group,the dryheat desert environment group appeared two ALT peaks at 2h group and 8h group,the normal temperature group appeared two ALT peaks at 2h group and 12h group.ConclusionThe expressions of NFκB in hepatic tissues in pigs of intestinal perforations due to abdominal firearm wound in dryheat desert environment group were significantly elevated and accompanied with the damage of hepatic function，the peaks of NFκB and ALT appeared earlier in dryheat desert environment groups than in normal temperature environment group,which suggested that protective measure of target NFκB for liver injury should be adopted in abdominal firearm wound in dryheat desert environment as early as possible.

　　Key words:abdominal injury;liver injury;firearm wound;desert environment;NFκB

　　核因子κB(NFκB)作为一种普遍存在的转录因子，是多种信号转导途径的汇聚点，在调节炎症反应的基因中起关键作用[1]。研究表明NFκB广泛存在于肝脏各种细胞中，通过调节众多基因的转录参与肝脏的病理生理过程[2]。本实验以我们已经建立的猪腹部火器伤肠管穿透模型为基础[3，4]，探讨沙漠干热环境下腹部肠管火器伤后NFκB在肝脏组织中的表达及肝脏功能的变化，为沙漠干热环境下腹部火器伤创伤机制的研究和救治奠定基础。

　　材料与方法

　　1实验动物分组及环境

　　选用解放军63650部队提供的健康长白仔猪84头，2~3月龄，体重27~33kg，雌雄不限，随机分为沙漠干热环境组和常温环境组，每组均为42头，每组又随机等分为对照组、伤后1、2、4、8、12小时和24小时组7个亚组。沙漠干热环境组实验场地位于新疆塔克拉玛干沙漠边缘，时间在2006年的7月下旬~8月初，实验从中午12时开始，沙漠干热环境组实验动物在沙漠干热环境下预热 3小时后致伤，平均气温(41.2±0.9)℃，平均相对湿度(22.3±1.3)%，辐射热强度>4.184J/(cm2.min);常温环境组实验动物在常温环境下致伤，常温及实验室环境：平均温度(23.7±0.4)℃，平均相对湿度(55.6±1.4)%。沙漠干热环境组和常温环境组动物在致伤后15分钟内转移到实验室进行观察。

　　2方法

　　2.1腹部火器伤模型参照文献[3]的方法建立腹部肠管火器伤模型：将长白仔猪应用氯胺酮肌肉注射麻醉后，将猪行走位悬吊于戈壁军用靶场门廊上，呈四肢自然下垂的“腾空行走位”，完全暴露腹部，于脐水平后方2cm处右侧腹壁皱襞下缘无毛区标记射击点，专业射手用手枪距猪侧腹壁30cm处瞄准射击点，从右侧腹壁垂直射入，左侧对应位置射出弹头，实验组于伤后相应时间点麻醉开腹，每组动物均取肝左中叶下段肝组织，10%中性甲醛固定，常规石蜡切片。沙漠干热环境组和常温环境组中的对照组除不致伤外，其余步骤与致伤组相同。

　　2.2血清肝生化测定实验各组分别于伤后各时间点剖腹前抽取猪耳缘静脉血，对照组被运回实验室后立即抽血，静置30分钟后离心，东芝全自动生化分析仪(TBA40FR)测血清中谷丙转氨酶(ALT)水平。

　　2.3免疫组化图像分析法检测NFκB的表达按NFκB/P65免疫组化试剂盒(购自博士德公司)说明操作。参照文献[5]所介绍的方法用Imagepro Plus 5.0医学图像分析软件检测每组细胞阳性染色的累积光密度值，用来表示NFκB的活性。每张切片随机选取5个不重叠的高倍镜视野分析，分析过程中所有切片的放大倍数(×400)光源强度均相同。

　　2.4统计学处理

　　实验数据以x±s表示，应用 SPSS 11.0统计软件进行统计学分析，采用OneWay ANOVA过程进行成组设计的方差分析。结果

　　1动物存活情况

　　常温环境组伤后1、2、4、12小时组动物全部存活，伤后8、24小时组各死亡1头;沙漠干热环境组2、4、8、24小时组各死亡1头，12小时组死亡2头。

　　2肝组织NFκB表达

　　NFκB染色阳性(黄色、棕黄色颗粒，图1、2)细胞以肝细胞和枯否细胞为主，对照组可见细胞浆有阳性染色，多数细胞核无明显染色。各实验组胞浆染色减弱，胞核呈现明显的阳性染色，随伤后时间的延长胞核染色强度逐渐增强。用医学图像分析系统检测各组NFκB表达，经统计学处理，伤后各组NFκB表达均明显高于对照组，沙漠干热环境组于伤后1小时和4小时出现2个高峰;常温环境组于伤后1小时和8小时出现2个高峰。在各个时间点，除8小时组外，其余各干热环境组的NFκB表达明显高于常温组(P<0.01)(表1)。

　　3血清ALT的变化

　　沙漠干热环境实验组和常温环境实验组伤后各组血清ALT水平均高于对照组(P<0.01)，干热环境实验组于伤后2小时和8小时出现2个高峰。常温环境实验组于伤后2小时和12小时出现2个高峰。在1、4、8小时组中沙漠环境组ALT明显高于常温环境组(P<0.01)(表1)。表1肝脏NFκB表达灰度(IOD)及血清ALT变化(略)

　　实验各组与对照组比较：P<0.05;实验各组与本组前一时间点比较：P<0.05;在同一时间点沙漠干热环境与常温环境相比：△P<0.01

　　讨论

　　腹部火器伤后由于枪伤应激、火器伤的远达效应、肠穿孔后化学性腹膜炎、穿孔周围肠壁挫裂震荡和烧灼坏死以及肠屏障受损可能易造成内毒素(LPS)血症、细菌移位和大量炎症因子入血;在原来急性创伤的基础上由于肠穿孔所致腹腔感染会导致了脓毒症逐渐发生。胃肠道通过门静脉系统与肝脏联系密切，腹部火器伤肠管穿透后易导致邻近器官肝脏的损伤，并进一步发展成为多器官功能障碍综合征(MODS)[6]。正常情况下，NFκB通常以同源二聚体或异二聚体形式与其抑制蛋白IκB结合，以非活性形式存于细胞质中。当细胞受到某种致病因素的刺激如细胞因子、氧自由基、炎症介质等，使抑制蛋白IκB磷酸化降解，与NFκB分离。NFκB蛋白活化后转移到细胞核内，与特定基因启动子或增强子上的相应位点结合而调节基因转录，激活与细胞应激相关的基因和炎症早期反应基因，产生大量的炎症因子[7]。因NFκB在多种炎症介质的表达调控中均具有重要作用，因而倍受关注，NFκB的适度活化对机体抵御病原微生物的危害具有重要意义，但过度活化并导致多种炎症介质的过量表达释放则是引起脓毒症以及多器官功能障碍综合征(MODS)发生的重要机制。

　　我们的研究发现，伤后各组NFκB表达均明显高于对照组，沙漠干热环境组于伤后1小时和4小时出现2个高峰(P<0.05);常温环境组于伤后1小时和8小时出现2个高峰(P<0.05)。在各个时间点，除8小时组外，其余各干热环境组的NFκB表达明显高于常温组(P<0.01)。在常温环境和沙漠干热环境下腹部火器伤肠管穿透后猪血清ALT迅速增高，ALT是检测肝损伤的经典指标，血清中ALT水平升高是肝细胞膜损伤的结果[8]，两环境组均于伤后2小时达到第1个高峰值，沙漠干热组ALT的第2个高峰值出现在8小时，而常温组出现在12小时。在1、4、8小时3个时间点，沙漠干热环境ALT明显高于常温组(P<0.01)。表明腹部肠管火器伤后，NFκB的表达明显增加并呈动态变化，其变化趋势和肝脏功能受损状态一致，提示NFκB可能在火器后介导肝脏功能损害过程中起重要作用。沙漠干热环境下NFκB的表达与肝功能受损的变化均较常温组提前。腹部火器伤后由于枪伤应激、肠屏障受损以及子弹的远隔效应导致了肝脏的急性损伤，使NFκB的表达和ALT分别在1小时和2小时迅速达第1高峰;第2个峰值产生的原因可能是在原来急性创伤的基础上由于肠穿孔所致腹腔感染导致了脓毒症，大量LPS经门静脉入血，从而使NFκB的活性增加，并肝功能受损明显。沙漠干热环境组NFκB表达和ALT均较常温环境组提高，而且峰值提前出现，可能是由于在高热环境的热应激状态下，细菌繁殖和生长加快，更加速了脓毒症的发生和LPS的入血。LPS可直接或通过炎性因子的作用引起肝细胞的坏死[7],由于肝损伤机制的复杂性使NFκB表达和ALT在伤后24小时内有波动，但二者的变化趋势基本一致。

　　尽管沙漠干热环境腹部火器伤肠管穿透后继发性肝损伤的发生机制有待进一步研究，但本研究提示在沙漠干热环境组NFκB表达和ALT均较常温环境组提高，而且峰值提前出现，提示在沙漠干热环境下腹部肠管火器伤后靶向NFκB的干预治疗应及早进行。

　　【参考文献】

　　[1]Chen F,Castranofa V,Shi XL.New insights into the role of nuclear factorκB in cell growth regulation[J].Am J Pathol,2001,159(2):387-397.

　　[2]李泽信，刘江伟，张永久，等.NFκB与肝细胞凋亡[J].中国现代普通外科进展，2006，9(5)：259-261.

　　[3]刘江伟，张永久，李泽信，等.常温和干热环境下腹部肠管火器伤动物模型的建立[J].创伤外科杂志，2007，9(5)：408-410.

　　[4]李泽信，冯德元，张永久，等.猪腹部火器伤肠管穿透后肝脏功能和形态的变化[J].中国现代普通外科进展，2007，10(1)：45-47.

　　[5]杨光田，刘德红，李树生，等.全身炎症反应综合征患者核因子κB活性与与预后的关系[J].中华急诊医学杂志，2005，14(1)：57-60.

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　　[7]Garg A，Aggawal BB.Nuclear transcription factorκB as a target for cancer drug development[J].Leukemia,2002,16(6):1053-1068.

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